DB1302/T 474-2017 柴胡根腐病菌鉴定方法
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- 标准类型：食品地方标准
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-06-07
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资料介绍
标准主要内容总结
1. 标准基本信息
- 标准编号：DB1302/T 474-2017
- 名称：柴胡根腐病菌鉴定方法
- 发布单位：唐山市质量技术监督局
- 起草单位：唐山师范学院
- 主要起草人：客绍英、姜峰等6人
2. 适用范围
- 适用于以镰刀菌属（尤其是茄腐镰刀菌 Fusarium solani）为主要致病菌的柴胡根腐病菌检测与鉴定。
3. 规范性引用文件
- 引用SN/T 2122《进出境植物及植物产品检疫抽样》规范田间取样方法。
4. 方法原理
通过以下四方面综合鉴定病原菌：
- 症状观察：根茎交界处组织变粗、变脆、颜色加深并伴有裂隙。
- 形态学特征：菌落形态、孢子类型（小型/大型分生孢子、厚垣孢子）及显微结构。
- 生物学特性：在选择性培养基（PCNB）和PDA上的生长特性。
- 分子生物学：PCR扩增ITS序列并比对NCBI数据库。
5. 关键实验材料与设备
- 仪器：显微镜、PCR仪、电泳系统、超净工作台等。
- 试剂：CTAB提取液、TAE缓冲液、蛋白酶K、PCR试剂（引物ITS1/ITS4）。
- 培养基：
- PDA培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂。
- PCNB选择性培养基：添加五氯硝基苯和硫酸链霉素，pH调至4.0抑制杂菌。
6. 操作流程
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田间取样：
- 拔取病株，检查根茎交界处典型症状（黑褐色病斑、腐烂）。
- 按SN/T 2122规范取样。
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病原菌分离与纯化：
- 病健交界组织经次氯酸钠消毒后，接种PCNB培养基（25~28℃，2~3天）。
- 挑取灰白色菌丝转接PDA纯化。
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形态学鉴定：
- 菌落特征：PDA上白色绒毛状菌落，不易产孢。
- 显微特征：
- 小型分生孢子：椭圆形或肾形，单/双胞，假头状聚集。
- 大型分生孢子：镰刀形，3隔膜为主（占99%）。
- 厚垣孢子：球形，顶生或间生。
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分子生物学鉴定：
- DNA提取：CTAB法或试剂盒提取基因组DNA。
- PCR扩增：使用通用引物ITS1/ITS4（产物347 bp）。
- 测序比对：BLAST分析，相似度≥99%判定为茄腐镰刀菌。
7. 结果判定
- 需同时满足：
- 形态学特征符合附录B描述（菌落、孢子类型）。
- PCR产物序列与已知茄腐镰刀菌相似度≥99%。
8. 附录内容
- 附录A：培养基配制方法（PDA、PCNB）。
- 附录B：病害典型症状及病原菌显微照片（根腐症状、菌落形态、孢子类型）。
- 附录C：PCR详细步骤（缓冲液配方、电泳条件）。
- 附录D：引物序列（ITS1/ITS4）及预期产物大小（347 bp）。
9. 其他说明
- 病害背景：柴胡根腐病为土传病害，高温高湿易发，6~7月为盛发期。
- 质量控制：实验需设阳性、阴性及空白对照。
核心要点
该标准提供了从田间症状观察到实验室分子鉴定的完整流程，强调形态学与分子生物学结合的综合判定方法，确保对柴胡根腐病菌（茄腐镰刀菌）的准确鉴定。