DB54/T 0462-2025 羊传染性脓疱病诊断技术规范

ICS 11.220
CCS B 41
54
西藏自治区地方标准
DB54/T 0462—2025
羊传染性脓疱病诊断技术规范
2025 - 05 - 10 发布2025-06 - 10 实施
西藏自治区市场监督管理局 发布

目次
前言..................................................................................II
1 范围................................................................................1
2 规范性引用文件......................................................................1
3 术语和定义..........................................................................1
4 生物安全措施........................................................................2
5 临床诊断............................................................................2
6 病毒分离培养........................................................................3
7 分子生物学诊断......................................................................4
8 综合判定............................................................................5
附录A（资料性） 相关症状图片..........................................................6
附录B（资料性） 聚合酶链式反应(PCR)产物电泳图.........................................9
附录C（资料性） 实时荧光定量PCR 结果图...............................................10
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II
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所提出。
本文件由西藏农业农村标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、云南农业大学。
本文件主要起草人：四朗玉珍、富国文、格桑卓嘎、班旦、樊月圆、拉巴次旦、吴金措姆。
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羊传染性脓疱病诊断技术规范
1　范围
本文件提出了羊传染性脓疱病的生物安全措施、临床诊断、病毒分离培养、分子生物学诊断技术要
求。
本文件适用于羊传染性脓疱病的诊断。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫
NY/T 3235 羊传染性脓疱诊断技术
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
羊传染性脓疱病
亦称羊口疮、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎，由羊传染性脓疱病毒导致的山羊、绵羊接触
性、嗜上皮性传染病。
3.2　
聚合酶链式反应
英文全称Polymerase Chain Reaction，缩写为PCR，由引物选择性体外扩增DNA或RNA片段的检测方
法。
3.3　
双蒸水
双蒸水，是重蒸水的一种，是将经过一次蒸馏后的水再次蒸馏所得到的水（二级水）。
3.4　
聚合酶链式反应预混液
英文名称PCR Master Mix，PCR试验时使用的预混物。
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3.5　
DNA 标记物
英文名称DNA Marker，特定分子量大小的DNA片段混合物，用于估算样品DNA分子量的大小。
3.6　
荧光定量PCR 探针法
除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，此时，两个基团平衡
不发光；当DNA通过引物合成时，探针被折断，释放出发光基团和淬灭基团，两个距离较远，发光基团
产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量。
3.7　
循环阈值
也称Ct值，在荧光定量PCR中，每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数。
4　生物安全措施
样品采集及处理的生物安全措施按GB 19489 的规定执行。
5　临床诊断
5.1　流行病学
绵羊和山羊均易感，各年龄段的羊均可发病，以1月龄～6月龄多发，成年羊呈散发。除能感染羊外，
该病毒对其他反刍动物和人类也具有感染能力。
一年四季均可发病，常呈群发性流行。自然放牧条件下，冬春季节多发。
病羊是该病的主要传染源，受到污染的圈舍、栏杆、垫草、饲槽以及饲草等都存在病毒，可经皮肤
黏膜损伤处感染其他羊。
5.2　临床症状
5.2.1　唇型
唇型的临床症状及病理变化表现为上唇、鼻镜、口角等部位出现小红疹，逐渐演变为小结节和疣状，
最后破溃形成硬痂，症状见附录A.1。
5.2.2　蹄型
蹄型多见于绵羊，常表现为一肢患病，其临床症状及病理变化表现为蹄叉、蹄冠、系部皮肤出现水
疱、脓疱，破溃后形成溃疡，症状见附录A.2。
5.2.3　外阴型
外阴型较少见，母羊临床特征及病理变化主要表现为有脓性或黏性阴道分泌物，阴唇及周围皮肤有
溃疡，症状见附录A.3；公羊出现阴鞘肿胀、脓疱、溃疡。
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5.2.4　乳房型
乳房型表现为乳头和乳房皮肤出现脓疱，后形成痂垢，症状见附录A.4。
5.2.5　其他类型
体表皮肤感染临床症状与病理变化与唇型相似。小肠和肠系膜感染其临床特征及病理变化主要表现
为体温升高大于39.5℃、精神萎靡、腹腔积液，小肠浆膜表面出现黄白色溃疡灶，肠系膜上出现大小不
一的圆形或椭圆形脓疱，病理变化见附录A.5。
5.3　结果判断
根据临床症状，可判定为羊传染性脓疱病疑似病例。
6　病毒分离培养
6.1 病料采集、处理及运输
6.1.1 痂皮
采集发病羊患处痂块0.5 g～1.0 g，用无菌生理盐水漂洗3次后剪碎，研磨并以无菌生理盐水按1: 10
制成悬液，加青霉素、链霉素各2000 IU/mL，置4 ℃冰箱过夜，3000 r/min、离心l0 min，取上清，当
日不能送到实验室诊断，则样品于-20 ℃保存，再送检，运输中保证密封、低温状态。
6.1.2 水泡液
用无菌注射器抽取丘疹水泡液，置于含2倍体积无菌生理盐水中的灭菌离心管中，加青霉素、链霉
素各2000 IU/mL，3000 r/min 离心l0 min，取上清，当日不能送到实验室诊断，则样品于-20 ℃保存，
再送检，运输中保证密封、低温状态。
6.2 主要仪器设备
高速冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、透射电子显微镜、紫外灯、冰箱、可调
微量移液器20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL。
6.3 试剂耗材
细胞培养液（含DMEM细胞培养液90%、胎牛血清10%、青霉素100 IU/mL和链霉素100 mg/ mL构成）、
细胞维持液（含DMEM细胞培养液98%、胎牛血清2%、青霉素100 IU/mL和链霉素100 mg/ mL构成）、25 cm2
细胞培养瓶、0.22 μm滤器、15 ml离心管、滤纸、碳支持膜铜网、2%磷钨酸、无菌移液器枪头20 μL～
200 μL、200 μL～1000 μL。
6.4 细胞制备
犊牛睾丸原代细胞、犊牛肾原代细胞或羊皮肤细胞任一种，制备方法参照NY/T 3235执行。
6.5 细胞处理方法
待6.4中的细胞长成良好的单层后，倒掉细胞培养液。将6.1.1或6.1.2中病料处理液用0.22μm滤器
过滤，取1 ml接种于细胞表面，37 ℃吸附1 h。吸出病料处理液，加入细胞维持液4 mL，置37 ℃、5% CO2
培养箱中培养。
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将出现病变的细胞与培养液一起反复冻融3次，吸出，置于15 ml离心管中，3000 rpm离心30 min，
取上清滴于碳支持膜铜网上，3 min～5 min后用滤纸吸去多余液体，再将2%磷钨酸滴于碳支持膜铜网上，
2 min～3 min后用滤纸吸去多余液体，室温放置干燥，置于透射电子显微镜下观察。
6.6 判定
每天观察细胞变化，连续观察5 d。如6.4中细胞在接种后1 d～5 d内出现变圆、肿胀、间质增宽、
折光性增强、团聚、脱落等细胞病变，于透射电子显微镜下观察到椭圆形病毒粒子，长250 nm～ 280
nm，宽170nm ～200 nm，判为病毒分离阳性。盲传3代无细胞病变，则判为病毒分离阴性。
7　分子生物学诊断
7.1　样品DNA 提取
取6.1.1或6.1.2的痂皮或水泡液处理上清液，使用病毒DNA提取试剂盒提取核酸，操作步骤按照病
毒DNA提取试剂盒说明书进行。
7.2　PCR 检测
7.2.1　主要仪器设备
生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、旋涡混合振荡器、电脑、冰箱、微
波炉、微量移液器2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL。
7.2.2　试剂耗材
双蒸水、PCR Master Mix、电泳缓冲液、DNA Marker、琼脂糖、PCR反应管、无菌移液器吸头。
7.2.3　引物
PCR引物序列如下：
——上游引物：5'-GAGGGCGTCGACATCACG-3'；
——下游引物：5'-CCGGCACCATCGAGAGCA-3'。
使用时配制成10 μmol/L工作液，置-20℃保存。
7.2.4　反应体系与反应程序
按25 μL体系配制。取7.1中样品DNA1 μL、PCR Master Mix 12.5 μl、7.2.3中上下游引物各1 μl、
ddH2O 9.5 μl。
反应程序：95℃预变性4 min；95℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸40 s，35个循环；72℃再延
伸10 min。
7.2.5　电泳检测
制备1.5%电泳琼脂糖凝胶，取5 μl~8 μl样品PCR扩增产物加入上样孔，同时加入阳性和阴性对照以
及DNA Marker，于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳，凝胶成像仪观察结果。
7.2.6　结果分析与判定
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阳性对照、样品PCR扩增产物与预期片段大小一致，在505 bp附近有明亮条带，同时阴性对照无条
带，判定为阳性，参见附录B。
样品PCR扩增产物测序后Blast比对结果为羊传染性脓疱病毒B2L基因，判定结果为阳性。
7.3　 荧光定量PCR 检测（探针法）
7.3.1　主要仪器设备
超净工作台、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、旋涡混合振荡器、电脑、冰箱、微量移液器2
μL～20 μL、0.5 μL～10 μL。
7.3.2　试剂耗材
双蒸水、2×qPCR Probe Master Mix、Eppendorf管、荧光定量PCR反应管、无菌移液器枪头。
7.3.3　引物与探针
荧光定量PCR引物及探针序列如下：
——上游引物：5'- GGGGCGGCGTATTCTTCT -3'；
——下游引物：5'- GCTGTTCTTGGCGTTCTCG -3'；
——TaqMan 探针（FAM）5'-ATCGTGCGGTAGAAGCCCAG-3'（BHQ1）。
使用时配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存。
7.3.4　反应体系与反应条件
以病毒DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增。按25μl体系配制：ddH2O 8.5 μl、7.3.3 中上下游引物
各0.4 μl、TaqMan探针0.2 μl、7.1中样品DNA0.5 μl、2×qPCR Probe Master Mix 10 μl。
反应程序：37℃污染消化2 min；95℃预变性5 min，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，45个循环。
7.3.5　结果分析与判定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器
可根据仪器噪音情况进行调整。空白对照、阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤35，
并出现特定的扩增曲线，参见附录C。如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此试验视为无效。
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无羊传染性脓疱病毒核酸。Ct值≤35，且出现特定的扩增曲线，表
示样品中含有羊传染性脓疱病毒核酸。Ct值＞35，且出现典型扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上
述结果的，判定为阳性。
8　综合判定
符合流行病学和临床症状，可判定为羊传染性脓疱病疑似病例。样品病毒分离培养及透射电子显微
镜形态学观察、PCR、荧光定量PCR结果中有一项检测结果为阳性，可判定为羊传染性脓疱病确诊病例。
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A
A
附　录　A
（资料性）
相关症状图片
A.1　口唇型：口唇处出现大小不等的疣状增生
A.2　蹄型：蹄部出现桑葚样增生
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A.3　外阴型：外阴部出现大小不等的疣状增生
A.4　乳房型：乳房部出现脓疱、痂垢
A.5　其他部位病变：肠系膜上出现大小不一的圆形或椭圆形脓疱
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B
B
附　录　B
（资料性）
聚合酶链式反应(PCR)产物电泳图
说明：
M.DL 2 000 Marker；
1、2、3——阳性样品；
4——阴性样本
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C
C
附　录　C
（资料性）
实时荧光定量PCR 结果图
说明：
a——阳性样本
b——阴性样本