DB54/T 0450-2025 藏猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR 检测技术规范

DB54/T 0450-2025《藏猪流行性腹泻病毒荧光定量 RT-PCR 检测技术规范》主要内容的详细总结：

​​核心目标：​​ 本标准规定了使用荧光定量逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 方法检测藏猪中猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 的技术规范，适用于藏猪相关样本的定性和定量检测。

​​详细内容分解：​​

1. ​​范围 (Scope):​​

   • 明确本文件规定了藏猪 PEDV 荧光定量 RT-PCR 检测所需的仪器设备、试剂耗材、样品采集处理、核酸提取、RT-PCR 操作程序、结果判定及生物安全要求。
   • 适用范围：藏猪的肠道内容物、粪便、肠道组织样品中 PEDV 的检测。

2. ​​规范性引用文件 (Normative References):​​

   • 列出了执行本标准时必须遵循的相关国家标准和行业标准，包括：
     • GB/T 1.1-2020: 文件起草规则。
     • GB 19489: 实验室生物安全通用要求。
     • GB/T 6682: 分析实验室用水规格。
     • NY/T 541: 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范。
     • NY/T 1948: 兽医实验室生物安全要求通则。
     • SN/T 4835: 实验室生物废弃物管理要求。

3. ​​术语和定义 (Terms and Definitions):​​

   • 明确定义了标准中使用的关键术语：
     • ​​RT-PCR (3.1):​​ 逆转录聚合酶链式反应。将 RNA 逆转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。
     • ​​荧光定量 PCR (3.2):​​ 在 PCR 体系中加入荧光基团，实时监测荧光信号以进行定性和定量分析。
     • ​​Ct 值 (3.3):​​ 循环阈值。荧光信号达到设定阈值时的循环数。

4. ​​缩略语 (Abbreviations):​​

   • 列出了标准中使用的主要缩略语及其全称，如 PEDV, DEPC, PBS, PCR, RT-PCR, RNA, cDNA, FAM, TAMRA, Ct, ddH₂O。

5. ​​仪器和设备 (Instruments and Equipment):​​

   • 详细列出了检测所需的核心和辅助设备：
     • 核心：荧光定量 PCR 仪、高速冷冻离心机、组织研磨器/研钵。
     • 辅助：高压灭菌锅、生物安全柜、分析天平、微量移液器、容量瓶、制冰机等。

6. ​​试剂和耗材 (Reagents and Consumables):​​

   • 明确了试剂纯度和用水要求（分析纯，无 RNA 酶污染，GB/T 6682 水）。
   • 列出了必需的具体试剂和耗材：
     • 耗材：无 RNA 酶的离心管、PCR管/八联管、吸头。
     • 核心试剂：病毒 RNA 提取试剂盒（商品化）、RT-PCR 反应试剂盒（商品化）、荧光定量 PCR 预混液（指定使用 ​​2X AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2​​ 或其他等效商品化探针法试剂）。
     • 溶液：DEPC 水（配制方法见附录 A 或商品化）、PBS (0.01 mol/L, pH7.4，配制方法见附录 A 或商品化）。
     • 特异性试剂：PEDV 特异性荧光定量 PCR 引物和 TaqMan 探针（名称和序列见附录 B）。
     • 对照品：
       • 阳性质粒对照：基于 PEDV GD-XL-2019 毒株 M 基因构建的 pCAGGS-M 质粒，工作浓度 ≥ 10^6 copies/μL。
       • 阴性对照：DEPC 水。

7. ​​样品采集和处理 (Sample Collection and Processing):​​

   • ​​采集工具：​​ 要求无菌且经过特定方式灭菌（高压蒸汽或干热）。
   • ​​样品采集：​​
     • 粪便/肠道内容物： 使用 PBS 润湿的无菌拭子采集 ≥ 0.5g。
     • 肠道组织： 无菌剪取 ≥ 5g。
   • ​​保存与运输：​​ 规定不同温度下的保存时限（立即检测、4℃ ≤24h、-20℃ ≤1个月、-80℃ ≤6个月），运输需低温，符合 NY/T 541。
   • ​​样品处理：​​
     • 粪便/肠道内容物： 加 PBS 混匀，反复冻融 2-3 次，离心取上清。
     • 组织样品： 剪碎，加 PBS 研磨成匀浆，反复冻融 2-3 次，离心取上清。
   • 处理后的上清液用于后续核酸提取。

8. ​​核酸提取 (Nucleic Acid Extraction):​​

   • 规定使用 ​​商品化的病毒组 RNA 提取试剂盒​​ 从处理好的样品上清液中提取 RNA。
   • 操作严格遵循所选试剂盒的说明书。

9. ​​荧光定量 RT-PCR 操作程序 (Fluorescence Quantitative RT-PCR Procedure):​​

   • ​​1. 逆转录 (RT)：​​ 使用商品化 RT-PCR 反应试剂盒，根据其说明书将提取的 RNA 逆转录成 cDNA。
   • ​​2. 荧光定量 PCR：​​
     • 使用上一步获得的 cDNA 作为模板。
     • ​​反应体系：​​ 明确规定了 10μL 反应体系的具体成分和体积（详见附录 C 表 C.1），包括预混液、引物、探针、模板 cDNA 和 ddH₂O。强调了在试剂配制区配制混合液，并按样本数+阳对照+阴对照的数量准备反应管。
     • ​​反应条件：​​ 明确规定了 PCR 仪上的三步程序（详见附录 C 表 C.2）：
       • Stage 1 (污染消化)： 37℃, 2 min (1 cycle)
       • Stage 2 (预变性)： 95℃, 5 min (1 cycle)
       • Stage 3 (扩增)： 95℃, 10 sec -> 60℃, 30 sec (45 cycles)

10. ​​结果判定 (Result Interpretation):​​

    • ​​阈值设定：​​ 根据仪器噪声调整，使阈值线略高于阴性对照扩增曲线的最高点。
    • ​​质控标准 (必须同时满足)：​​
      • 阴性对照：无 Ct 值或 Ct > 40，无典型扩增曲线。
      • 阳性对照：Ct ≤ 35，有明显对数增长曲线。
      • 不满足则本次实验无效。
    • ​​样品判定：​​
      • ​​阳性：​​ Ct ≤ 35 ​​且​​ 有典型扩增曲线。
      • ​​阴性：​​ 无 Ct 值 ​​且​​ 无扩增曲线。
      • ​​可疑 (Ct > 35 且有典型曲线)：​​ 需重复检测。
        • 重复后 Ct ≤ 35 ​​且​​ 有典型曲线：判为阳性。
        • 否则：判为阴性。

11. ​​生物安全措施 (Biosafety Measures):​​

    • 强调整个流程（采样、处理、保存、运输、检测、废弃物处理）必须严格遵守所列的国家和行业生物安全标准：GB 19489, NY/T 541, NY/T 1948, SN/T 4835。

12. ​​规范性附录 (Normative Appendices):​​

    • ​​附录 A: 试剂配制​​
      • A.1 DEPC 水：详细配制步骤（DEPC 处理，高压灭菌）。
      • A.2 PBS (0.01 mol/L, pH7.4)：详细配方（NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄ 用量）、pH 调节方法、定容、分装灭菌。
    • ​​附录 B: 引物和探针序列​​
      • 表 B.1 明确列出 PEDV 检测的特异性引物和探针名称、序列：
        • 上游引物 (Primer F): 5’-TGGAGCACCAACTGGTGTAA-3’
        • 下游引物 (Primer R): 5’-ACCGGACATAGAAAGCCCAA-3’
        • 探针 (Probe): 5’-FAM-CGTCACAGTCGCCAAGGCCA-TAMRA-3’ (标记 FAM 荧光报告基团和 TAMRA 荧光淬灭基团)
    • ​​附录 C: PCR 反应体系和条件​​
      • 表 C.1: 10μL 荧光定量 PCR 反应体系各成分的具体体积和终浓度。
      • 表 C.2: 荧光定量 PCR 反应的具体循环程序（温度、时间、循环数）。

​​总结要点：​​

该标准为西藏地区藏猪 PEDV 的检测提供了一个高度标准化、基于 TaqMan 探针法的荧光定量 RT-PCR 操作流程。它详细规定了从样品采集、前处理、RNA 提取、cDNA 合成、特异性 PCR 扩增与检测到结果判读的每一步骤，以及所需的仪器、试剂（包括关键引物探针序列）、质控标准和生物安全要求。附录提供了关键试剂配制、引物探针信息和反应体系/条件的规范性指导，确保检测结果的准确性、可靠性和可比性。该标准特别适用于藏猪相关样本（粪便、肠道内容物、肠道组织）中 PEDV 的快速、灵敏、特异的定性和定量检测。