NY/T 4498-2025 大葱品种鉴定 SSR分子标记法

以下是对《NY/T 4498-2025 大葱品种鉴定 SSR分子标记法》标准的详细内容总结：

​​一、标准框架​​

1. ​​范围​​

   • 规定利用SSR标记进行大葱（Allium fistulosum var. giganteum）品种鉴定的方法，包括术语定义、操作流程、结果判定等。
   • 适用于大葱品种DNA数据采集和鉴定。

2. ​​规范性引用文件​​

   • 包括GB/T 3543.2（种子扦样）、GB/T 6682（实验用水）、NY/T 2594（DNA分子标记总则）。

3. ​​术语与定义​​

   • 沿用NY/T 2594的术语，如SSR、等位变异等。

4. ​​缩略语​​

   • 列出APS、bp、CTAB、dNTPs、PAGE、TBE等关键术语缩写。

​​二、核心原理​​

• ​​SSR标记原理​​：大葱基因组中SSR位点的重复次数存在品种间差异，通过PCR扩增特定SSR位点，结合电泳检测片段大小差异，实现品种区分。

​​三、关键操作流程​​

​​1. 样品准备​​

• ​​样品类型​​：种子、幼苗、叶片等（种子需按GB/T 3543.2扦样）。
• ​​样本量​​：每份样品≥30个个体，等量混合分析。

​​2. DNA提取（CTAB法）​​

• ​​步骤​​：
  1. 液氮研磨200mg样本，加入预热CTAB提取液（65℃水浴45~60min）。
  2. 三氯甲烷-异戊醇（24:1）抽提，离心取上清。
  3. 异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，TE缓冲液溶解。
• ​​质量控制​​：OD260/OD280比值需在1.7~2.0之间。

​​3. PCR扩增​​

• ​​反应体系（20μL）​​：

  组分	终浓度	体积（μL）
  10×缓冲液	1×	2.0
  dNTPs	0.2 mmol/L	1.6
  Taq酶	0.05 U/μL	0.2
  正/反向引物	0.25 μmol/L	各1.0
  DNA模板	2.5 ng/μL	2.0
  双蒸水	-	12.2

• ​​反应程序​​：
  • 94℃预变性5min → 35循环（94℃ 30s → 55℃ 30s → 72℃ 45s） → 72℃延伸10min → 4℃保存。

​​4. PCR产物检测​​

• ​​方法一：变性PAGE电泳​​
  • ​​制胶​​：6%聚丙烯酰胺胶（含尿素），亲和硅烷/剥离硅烷处理玻板。
  • ​​上样​​：PCR产物加6×上样缓冲液，95℃变性5min。
  • ​​电泳​​：1800V恒压，时间依片段大小调整（如200bp约2.5h）。
  • ​​银染​​：固定→染色→显影→定影，观察条带。
• ​​方法二：荧光毛细管电泳​​
  • ​​多重检测​​：按附录F分组混合荧光标记引物产物（如FAM/HEX/ROX/TAMRA）。
  • ​​变性​​：95℃ 5min，冰浴冷却。
  • ​​上机​​：使用DNA分析仪（区分力1bp），配套软件分析片段大小。

​​5. 数据分析​​

• ​​等位变异记录​​：
  • 纯合位点：X/X（如160/160）
  • 杂合位点：X/Y（如160/165）
  • 缺失：0/0
• ​​结果比对​​：逐一比对送检样品与对照样品的每个位点，统计差异位点数。

​​四、结果判定​​

• ​​判定规则​​：
  • ​​不同品种​​：差异位点数 > 2
  • ​​疑似相同​​：差异位点数 ≤ 2
• ​​结果表述​​：

  "送检样品与对照样品采用[方法]检测，检测位点数[ ]，差异位点数[ ]，判定为[不同/疑同]。"

​​五、附录关键内容​​

​​附录A：仪器与试剂​​

• ​​仪器​​：PCR仪、电泳系统、离心机、分光光度计、DNA分析仪等。
• ​​试剂​​：CTAB、dNTPs、SSR引物、荧光染料（6-FAM/HEX/ROX/TAMRA）、银染试剂等。

​​附录B：溶液配制​​

• ​​DNA提取液​​：CTAB提取液（含2% CTAB、1.4M NaCl）、TE缓冲液等。
• ​​电泳相关​​：6%变性PAGE胶、10×TBE、银染试剂（固定液、染色液等）。

​​附录C：引物信息​​

• ​​20对SSR引物​​：名称、染色体位置、正/反向序列（如P01:AFS015, Chr1）。

​​附录D：引物参数​​

• ​​关键参数​​：

  引物	荧光标记	等位变异范围 (bp)	参照品种示例
  P01	6-FAM	329–364	夏薇（329bp）
  P02	HEX	124–147	辽葱6号（124bp）

​​附录E：参照品种​​

• ​​21个品种​​：青杂2号、辽葱6号、春香等，含保藏编号（如国家种质库XIN25051）。

​​附录F：引物分组（荧光毛细管电泳）​​

• ​​分组示例​​：

  组别	FAM标记	HEX标记	ROX标记
  1	AFS088	AFS156, AFA15E08	AFB20G05, AFA16D05

​​六、注意事项​​

1. ​​引物选择​​：普通引物用于PAGE，荧光标记引物用于毛细管电泳。
2. ​​参照品种​​：必须与样品同步检测，校正系统误差。
3. ​​特殊操作​​：
   • PAGE银染时显影液需现加甲醛。
   • 毛细管电泳前需预实验确定产物稀释倍数。
4. ​​判定灵活性​​：若早期差异位点已>2，可提前终止检测。

​​总结​​

该标准体系完整覆盖大葱SSR鉴定的全流程，强调标准化操作（如CTAB-DNA提取、严格PCR体系）、双电泳方法互补，并通过参照品种和阈值判定确保结果可靠性。附录提供关键参数支撑实操，适用于种子质检、品种权保护等场景。