NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法
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- 标准类型：深加工类
- 标准语言：中文版
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- 更新时间：2025-06-08
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资料介绍
以下是对NY/T 4630-2025《牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法》主要内容的详细总结：
一、标准基本信息
- 标准号：NY/T 4630-2025
- 发布日期：2025年1月9日
- 实施日期：2025年5月1日
- 归口单位：全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC 274）
- 起草单位：
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）等7家机构。 - 适用范围：
- 第一法（反相液相色谱法）：生牛乳、巴氏杀菌牛乳。
- 第二法（凝胶渗透色谱法）：高温杀菌牛乳、灭菌牛乳、牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉。
- 定量限：
样品类型 α-乳白蛋白 β-乳球蛋白 生乳/巴氏乳 25 mg/kg 100 mg/kg 高温杀菌乳/灭菌乳 50 mg/kg 100 mg/kg 乳粉/婴幼儿配方乳粉 250 mg/kg 500 mg/kg - 核心限制：仅适用于未变性的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定。
二、方法原理
第一法：反相液相色谱法
- 样品前处理：
- 样品用水溶解，调节pH至4.60，沉淀酪蛋白和变性乳清蛋白。
- 离心后取上清液稀释，过膜待测。
- 分离检测：
- 采用 C₄色谱柱（250 mm×4.6 mm, 3.5 μm），紫外检测器（210 nm）。
- 流动相：
- A相：0.1%三氟乙酸水溶液
- B相：0.1%三氟乙酸乙腈溶液
- 梯度洗脱（35分钟程序，乙腈比例5%→60%→5%）。
- 定量：外标法，β-乳球蛋白以A、B两峰面积之和计算。
第二法：凝胶渗透色谱法
- 样品前处理：
- 调节pH至4.60沉淀杂质，离心取上清液。
- 加入盐酸胍缓冲液（pH 7.5）和β-巯基乙醇，室温静置2小时，还原二硫键生成单体蛋白。
- 分离检测：
- 采用二醇基亲水硅胶柱（300 mm×4.6 mm, 2 μm），紫外检测器（280 nm）。
- 流动相：盐酸胍缓冲液（含磷酸盐、EDTA，pH 7.5）。
- 等度洗脱，流速0.18 mL/min。
- 定量：外标法，α-乳白蛋白与β-乳球蛋白独立定量。
三、关键试剂与仪器
通用要求
- 水：GB/T 6682一级水。
- 标准品：α-乳白蛋白（CAS 9051-29-0）、β-乳球蛋白（CAS 9045-23-2），纯度≥95%。
- 滤膜：0.22 μm水系滤膜。
方法特异性试剂
- 第一法：三氟乙酸、乙腈（色谱级）、乙酸（优级纯）。
- 第二法：盐酸胍、β-巯基乙醇、磷酸盐缓冲液（含EDTA）。
仪器设备
- 通用设备：
高效液相色谱仪（配紫外/二极管阵列检测器）、离心机（≥12,000 r/min）、pH计（±0.01精度）、涡旋混合器。 - 色谱柱：
- 第一法：C₄反相柱（300 Å孔径）。
- 第二法：凝胶渗透色谱柱（亲水硅胶）。
四、样品处理流程
生乳/巴氏乳（第一法）
- 称取5 g样品，加水混匀，乙酸调pH=4.60±0.05。
- 定容至25 mL，静置10分钟，12,000 r/min离心10分钟。
- 取1 mL上清液稀释至5 mL，过膜上机。
高温乳/灭菌乳（第二法）
- 称取12.5 g样品，加水混匀，盐酸调pH=4.60±0.05。
- 定容至25 mL，静置2小时，离心取1 mL上清液。
- 加3 mL盐酸胍缓冲液和50 μL β-巯基乙醇，定容至5 mL，静置2小时后过膜。
乳粉/婴幼儿乳粉（第二法）
- 称取2.5 g样品，加水20 mL溶解，调pH=4.60±0.05。
- 后续步骤同高温乳处理。
五、定量与数据处理
- 标准曲线：
- 第一法：1–200 mg/L（7个浓度点）。
- 第二法：5–600 mg/L（6个浓度点）。
- 要求相关系数 R² ≥ 0.99。
- 计算公式：
/omega_i = /frac{/rho_i /times V_{/text{定容}} /times V_{/text{样液}} /times 1000}{m_{/text{样品}} /times V_{/text{上清}} /times 1000} /times f/omega_i：含量（mg/kg）；/rho_i：曲线测得浓度（mg/L）；f：稀释倍数。
- 结果表示：平行测定两次，取算术平均值，保留3位有效数字。
六、质量控制要求
- 定性确认：
样品峰保留时间与标准溶液偏差≤±2.5%。 - 精密度：
平行测定结果的绝对差值≤算术平均值的 10%。 - 附录图谱：
- 附录A：反相色谱图（β-乳球蛋白分A、B双峰）。
- 附录B：凝胶渗透色谱图（β-乳球蛋白为单峰）。
七、关键注意事项
- 方法选择：
巴氏乳/生乳用第一法；高温处理产品或乳粉用第二法（需还原变性蛋白）。 - 时效性：
生乳/巴氏乳需立即测定；乳粉可常温密闭保存。 - 试剂现配：
三氟乙酸溶液、盐酸胍缓冲液、含巯基乙醇的处理液需临用现配。
总结
该标准针对不同乳制品特性制定了两套HPLC检测方案：
- 第一法：操作简捷，适用于未变性蛋白的液态乳。
- 第二法：通过化学还原处理，解决高温/粉状样品中蛋白变性导致的检测难点。
标准内容覆盖原理、试剂、仪器、步骤、计算及质控全流程，兼顾科学性与实操性，为乳品质量评估提供了权威技术依据。