NY/T 4647-2025 边界病诊断技术

​​NY/T 4647-2025《边界病诊断技术》主要内容总结​​

​​1. 范围​​

本文件规定了边界病（BD）的诊断技术，包括临床诊断、样品采集与处理、实验室检测方法（病毒分离与鉴定、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、病毒中和试验）及结果判定标准。适用于绵羊、山羊等动物的BD诊断、检疫、监测和流行病学调查。

​​2. 规范性引用文件​​

引用GB 19489、GB/T 27401、NY/T 541、NY/T 1948等标准，确保生物安全和实验室操作规范。

​​3. 术语与缩略语​​

• ​​BD​​：边界病，由边界病病毒（BDV）引起，以繁殖障碍和羔羊畸形为特征。
• ​​PI羊​​：持续性感染羊，终生带毒，是主要传染源。
• ​​CP/NCP型​​：BDV的致细胞病变型和非致细胞病变型。
• 其他缩略语如RT-PCR、TCID50等均明确定义。

​​4. 生物安全措施​​

实验操作需符合生物安全等级要求（如GB 19489），防止病毒泄漏和人员感染。

​​5. 临床诊断​​

• ​​流行病学​​：

  • 传染源：PI羊、流产胎儿及分泌物/排泄物。
  • 传播途径：垂直传播为主，也可通过消化道、呼吸道水平传播。
  • 易感动物：绵羊最易感，山羊、牛、猪等也可感染。
  • 流行特点：繁殖季节高发，羔羊表现为“多毛震颤病”（发育不良、神经症状）。

• ​​临床症状​​：

  • ​​急性感染​​：低热、腹泻、结膜炎，羔羊死亡率达50%。
  • ​​胚胎感染​​：妊娠早期流产，中期产弱羔（震颤、骨骼异常），晚期产正常羔羊但带抗体。
  • ​​PI羊​​：持续排毒，后期可能出现消瘦、呼吸困难等迟发病。

• ​​临床判定​​：符合流行病学特征且出现典型症状时判为疑似病例，需实验室确诊。

​​6. 样品采集与处理​​

• ​​样品类型​​：
  • 活畜：抗凝血、血清、棉拭子（眼、鼻、口腔）、精液。
  • 死畜/流产胎畜：肾、睾丸、脑、脾等组织（25–50g）。
• ​​保存与运输​​：
  • 组织样品用50%甘油-PBS保存，-70℃长期保存；运输需低温防漏。

​​7. 实验室诊断方法​​

​​（1）病毒分离与鉴定​​

• ​​细胞培养​​：使用绵羊/山羊睾丸或肾原代细胞，接种样品后观察CPE（细胞病变），盲传3代。
• ​​免疫荧光鉴定​​：通过荧光抗体染色检测病毒抗原，阳性结果需胞浆黄绿色荧光。

​​（2）RT-PCR​​

• 靶基因：5’UTR区（225bp片段）。
• 引物：PBD136F/PBD335R（附录B）。
• 结果判定：凝胶电泳出现225bp条带为阳性。

​​（3）实时荧光RT-PCR​​

• 探针法检测5’UTR区，Ct值≤36判为阳性。

​​（4）病毒中和试验​​

• 检测血清抗体，阳性血清可中和病毒（荧光染色阴性）。

​​8. 综合判定标准​​

• ​​确诊病例​​：临床疑似且实验室任一方法阳性。
• ​​隐性感染​​：无症状但实验室检测阳性。
• ​​既往感染​​：抗体阳性但病原检测阴性。

​​9. 附录​​

• ​​附录A​​：病毒分离试剂配制（如PBS、细胞培养液）。
• ​​附录B​​：引物/探针序列及电泳图示例。
• ​​附录C​​：核酸检测试剂（如TAE缓冲液）。
• ​​附录D​​：病毒繁殖与毒价测定方法。

​​关键点​​

• ​​技术先进性​​：与国际标准（如WOAH手册）接轨，结合我国流行毒株特性。
• ​​检测特异性​​：可区分BDV、BVDV和CSFV。
• ​​防控核心​​：重点检测PI羊（持续排毒），强调病原学检测的重要性。
• ​​多方法验证​​：提供病毒分离、分子检测、血清学等多途径确诊方案。

本文件为BD的早期诊断、疫情控制和净化提供了标准化技术依据。