NY/T 4667-2025 犬瘟热病毒、犬细小病毒检测 二重荧光PCR法

中国农业行业标准 NY/T 4667-2025 主要内容总结

1. ​​适用范围​​

• 适用于犬的全血、组织（脑、肝、脾、肺、肾、小肠、淋巴结等）、粪便、鼻拭子、眼分泌物及细胞培养物中 ​​犬瘟热病毒（CDV）​​ 和 ​​犬细小病毒（CPV）​​ 的核酸检测。

2. ​​规范性引用文件​​

• ​​GB/T 1.1-2020​​：标准化文件的结构与起草规则。
• ​​GB/T 6682​​：实验室用水规格。
• ​​SN/T 1193​​：基因检测实验室技术要求。

3. ​​核心试剂与材料​​

• ​​RNA提取​​：Trizol、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、DEPC水。
• ​​反转录试剂​​：AMV反转录酶（10 U/μL）、5×反转录预混液、dNTP（2.5 mmol/L）、RNase抑制剂（40 U/μL）。
• ​​PCR试剂​​：2×PCR预混液、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L）。
• ​​引物与探针​​（见附录A）：
  • ​​CDV检测​​：引物P1/P2，FAM标记探针P5（淬灭基团BHQ1）。
  • ​​CPV检测​​：引物P3/P4，HEX标记探针P6（淬灭基团BHQ2）。

4. ​​仪器设备​​

• 多通道荧光PCR仪、涡旋震荡仪、离心机（最高12,000g）、微量移液器（0.5-1000μL）、恒温水浴锅。

5. ​​样本采集与处理​​

• ​​全血​​：EDTA抗凝，混匀后直接提取。
• ​​组织/粪便​​：PBS匀浆，离心取上清。
• ​​拭子（鼻/眼）​​：PBS浸泡后离心取上清。
• ​​细胞培养物​​：冻融后离心取上清。
• ​​保存​​：4℃短期保存，-20℃长期保存。

6. ​​核酸提取流程​​

• ​​RNA提取（CDV）​​：
  1. Trizol裂解，三氯甲烷分层，异丙醇沉淀。
  2. 75%乙醇洗涤，DEPC水溶解。
  3. 反转录：72℃预变性5min，37℃反转录1h，94℃灭活酶。
• ​​DNA提取（CPV）​​：
  1. SDS/蛋白酶K裂解，沸水灭活。
  2. 三氯甲烷抽提，异丙醇沉淀，乙醇洗涤。
  3. DEPC水溶解。

7. ​​二重荧光PCR操作​​

• ​​反应体系（25μL）​​：
  • 2×PCR预混液12.5μL、Taq酶0.5μL、引物各0.8μL、探针各0.6μL、模板3μL（RNA反转录产物/DNA）。
• ​​扩增程序​​：
  1. 预变性：95℃ 5min。
  2. 40循环：95℃ 5s → 60℃ 35s（FAM/HEX通道收集信号）。

8. ​​结果判定​​

• ​​阈值设定​​：高于阴性对照扩增曲线最高点。
• ​​质控要求​​：
  • 阳性对照Ct≤30，阴性对照无Ct值。
• ​​判定标准​​：
  • ​​阳性​​：Ct≤35且有典型扩增曲线（FAM→CDV；HEX→CPV）。
  • ​​可疑​​：35<Ct≤40，需复测；复测仍为阳性则判为阳性。
  • ​​阴性​​：无Ct值或无扩增曲线。

9. ​​检测要求​​

• 实验室需符合 ​​SN/T 1193​​ 标准，防止交叉污染，分区操作（样本制备区、试剂准备区、扩增区）。

附录关键信息

• ​​附录A​​：引物探针序列（见表A.1）。
• ​​附录B​​：RNA/DNA提取详细步骤，包括离心参数（如12,000g离心15min）、试剂体积（如200μL样本+600μL Trizol）等。

注意事项

• ​​CDV（RNA病毒）​​ 需反转录步骤，​​CPV（DNA病毒）​​ 直接扩增。
• 不同样本处理差异（如组织匀浆与拭子离心条件）。
• 荧光通道独立分析，可同时检测双病毒感染。