NY/T 4549-2025 微生物肥料酶活效应测定方法

微生物肥料酶活效应测定方法总结

1. 适用范围

本文件适用于施用微生物肥料的土壤中8种常见酶活力测定，其他肥料处理土壤可参照执行。涉及酶类包括：脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、纤维素酶、硝酸盐还原酶、蛋白酶、磷酸酶和几丁质酶。

2. 核心测定方法

2.1 脲酶（苯酚钠-次氯酸钠比色法）

• ​原理​：脲酶分解尿素生成NH₃，与苯酚钠-次氯酸钠生成蓝色靛酚，比色定量。
• ​条件​：37℃、pH6.7反应24小时。
• ​单位定义​：产生1mg NH₃-N为一个酶活力单位（U）。
• ​关键试剂​：尿素溶液（10%）、柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）、苯酚钠-次氯酸钠显色体系。
• ​计算​：基于标准曲线，通过吸光度计算NH₃-N浓度，结合分取倍数、时间等参数计算酶活。

2.2 过氧化氢酶（高锰酸钾滴定法）

• ​原理​：酶催化分解H₂O₂，剩余H₂O₂用KMnO₄滴定。
• ​条件​：4℃反应1小时。
• ​单位定义​：消耗1mL 0.02mol/L KMnO₄为1U。
• ​关键步骤​：抽滤后用硫酸终止反应，滤液滴定。
• ​计算​：通过空白与样品消耗KMnO₄体积差计算酶活。

2.3 蔗糖酶（3,5-二硝基水杨酸比色法）

• ​原理​：蔗糖酶水解生成葡萄糖，与DNS试剂显色。
• ​条件​：37℃、pH5.5反应24小时。
• ​单位定义​：生成1mg葡萄糖为1U。
• ​显色体系​：沸水浴显色5分钟，540nm测定。
• ​空白试验​：需进行无蔗糖和无土空白校正。

2.4 纤维素酶（DNS比色法）

• ​原理​：纤维素酶水解生成葡萄糖，DNS显色。
• ​条件​：37℃、pH5.5反应72小时。
• ​单位定义​：生成1mg葡萄糖为1U。
• ​样品处理​：离心后取上清液显色，分取倍数需计算。

2.5 硝酸盐还原酶（酚二磺酸比色法）

• ​原理​：酶促反应后硝态氮减少量反映酶活，酚二磺酸显色。
• ​条件​：37℃厌氧培养24小时。
• ​单位定义​：硝态氮浓度差值为1U。
• ​关键步骤​：抽真空培养，铝钾矾沉淀干扰物。

2.6 蛋白酶（福林法）

• ​原理​：蛋白酶水解酪蛋白生成酚基氨基酸，与Folin试剂显色。
• ​分型测定​：酸性（pH3）、中性（pH7.2）、碱性（pH10.5）蛋白酶。
• ​条件​：40℃反应10分钟。
• ​单位定义​：生成1μg酪氨酸当量为1U。
• ​标准曲线​：需L-酪氨酸系列浓度。

2.7 磷酸酶（磷酸苯二钠比色法）

• ​原理​：酶解产物酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺显蓝色。
• ​分型测定​：酸性（pH5）、中性（pH7）、碱性（pH9.6）。
• ​条件​：37℃反应24小时。
• ​单位定义​：释放1mg酚为1U。

2.8 几丁质酶（比色法）

• ​原理​：酶解生成N-乙酰葡萄糖胺，与DMAB显红色。
• ​条件​：37℃培养18小时。
• ​单位定义​：生成1μg产物为1U。
• ​关键试剂​：胶态几丁质悬液（1%），需现制。

3. 通用要求

• ​样品处理​：按NY/T 1121.1采集，风干后过1mm筛（蛋白酶需0.25mm筛）。
• ​空白试验​：每个样品需做无底物空白和无土空白。
• ​精密度​：两次平行结果相对偏差≤20%（超过情况≤5%）。
• ​安全警示​：实验需在通风区域进行，避免阳光直射，操作者需穿戴防护装备。

4. 结果计算通式

酶活力（U/g）= [（样品浓度 - 空白浓度）×体积×分取倍数×时间系数] /（样品质量×反应时间×1000）

5. 仪器设备

• 共性仪器：分光光度计、恒温培养箱、离心机、天平（0.0001g精度）。
• 特殊设备：厌氧培养装置（硝酸盐还原酶）、真空泵（过氧化氢酶）。

6. 试剂管理

• 标准溶液需定期验证（如酚、葡萄糖等）。
• 部分试剂需低温避光保存（如DNS试剂、DMAB）。

7. 注意事项

• 显色反应需严格控制时间（如DNS沸水浴5分钟）。
• 样品吸光度超限时需调整稀释倍数。
• 不同酶的最适pH缓冲液需精确配制（如磷酸酶分三套缓冲体系）。

本标准通过规范化的操作流程和严格的质量控制，确保微生物肥料对土壤酶活效应的评估具有可比性和准确性，为农业微生物产品的效果评价提供科学依据。