NY/T 4522-2025 人参不定根组培技术规程

NY/T４５２２—２０２５
前　　言
本文件按照GB/T１?１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定
起草.
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.
本文件起草单位:中国标准化研究院、山东安然纳米实业发展有限公司、哈尔滨工业大学(威海)、深圳
市标准技术研究院、中国林科院林业所、天津大学.
本文件主要起草人:席兴军、张明臣、刘金坤、高秀君、杨志花、刘冰、宋颜香、裴东、高文远、闫培生.
Ⅰ
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人参不定根组培技术规程
１　范围
本文件确立了人参(Panaxginseng C?A?Mey?)不定根组培流程,描述了设备设施与仪器、试剂和材
料、培养基母液和培养基配制及保存、外植体前处理、组织培养、生产培养、清洗与干燥等阶段的操作指示
以及信息记录与档案等证实方法.
本文件适用于以鲜人参根为外植体,以生产高皂苷含量组织培养物为目的所开展的不定根组织培养.
２　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件.
GB６６８２　分析实验室用水规格和试验方法
LY/T１８８２—２０１０　林木组织培养育苗技术规程
３　术语和定义
LY/T１８８２—２０１０界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
３?１
人参不定根　adventitiousrootofPanaxginseng
人参种源诱导出愈伤组织、分化培养形成不定根,通过筛选获得工作种源,再经三级培养、清洗、干燥
等步骤制得的产品.
３?２
分化培养　differentiationculture
再次培养过程中,愈伤组织经过分化形成了不定根的过程,也称为不定根诱导.
３?３
外植体　explant
用于植物组织培养的各种器官组织.
[来源:LY/T１８８２—２０１０,３?３]
３?４
培养基母液　mediumstocksolution
按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液.
[来源:LY/T１８８２—２０１０,３?５]
３?５
诱导培养　inducingculture
在无菌条件下,将经体表面灭菌后的外植体植入培养基后,进行愈伤组织或不定根诱导的过程.
３?６
继代培养　subculture
外植体经过诱导培养后,再次及之后各次接种于新培养基继续培养的过程.
[来源:LY/T１８８２—２０１０,３?７,有修改]
３?７
扩大培养　extendedculture
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将继代培养之后的不定根,转入体积逐级增加的新液体培养基,实现大规模快速生产的过程.
４　人参不定根组培流程
人参不定根组培流程见图１.
图１　图１ 人参不定根组培技术流程
５　设备设施与仪器
５?１　设施
组织培养区域的空气洁净度应达到１０万级以上;无菌操作间整体空气洁净度应达到万级以上;超净
工作台应达到百级以上.
５?２　设备
５?２?１　超净工作台:不高于ISO５级(１００级)、平均风速０?３０m/s~０?６０m/s,需带紫外灯,功率８ W
以上.
５?２?２　高压蒸汽灭菌器(锅):最高使用压力０?２５５MPa.
５?２?３　恒温恒湿培养箱或培养室:温度调节范围０℃~６０℃、相对湿度调节范围４０％~９０％.
５?２?４　恒温振荡培养箱:温度调节范围５℃~６０℃、振荡频率２０r/min~３００r/min.
５?２?５　烘箱:最高温度≥２５０℃.
５?２?６　冰箱:调节范围－２０℃~０℃.
５?２?７　电子天平:感量０?０１g以下.
５?２?８　移液器(管):量程１?００mL、量程５?００mL.
５?２?９　pH 计:０?０１级pH 计,最小显示值０?０１.
５?２?１０　　纯净水机组或装置:电导率应小于５μS/cm(２５℃).
５?２?１１　生物反应器:具有剪切装置、具备可过滤０?０１μm 的空气过滤器、食品级不锈钢材料、通气量为
每升发酵液(培养基)每分钟通无菌空气０?１L~０?５L.
５?２?１２　无菌培养皿、手术刀、镊子、酒精灯等.
６　试剂和材料
６?１　蔗糖:食品级.
６?２　植物凝胶:植物细胞培养级.
６?３　B５培养基:植物细胞培养级.
６?４　WPM 培养基:植物细胞培养级.
６?５　１/２MS培养基:生化级.
６?６　６Ｇ苄氨基腺嘌呤:植物细胞培养级.
６?７　萘乙酸:植物细胞培养级.
６?８　赤霉素:分析纯.
６?９　吲哚乙酸:植物细胞培养级.
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６?１０　吲哚丁酸:植物细胞培养级.
６?１１　柠檬酸:植物细胞培养级.
６?１２　抗坏血酸:植物细胞培养级.
６?１３　纯净水:符合GB６６８２中三级水的要求.
６?１４　无菌水:经灭菌处理的纯净水.
７　培养基母液和培养基配制及保存
７?１　培养基母液
７?１?１　配制
７?１?１?１　配制用水为纯净水(６?１３).
７?１?１?２　母液配制方法见附录A.
７?１?２　保存
７?１?２?１　母液容器应贴有标签,标签中标注名称、配置倍数、配制日期、有效期和配制人.
７?１?２?２　发现标签不明或母液中有沉淀或浑浊现象以及密封不严的应停止使用.
７?１?２?３　母液保存条件和标签内容按附录A 执行.
７?２　培养基
７?２?１　配制
７?２?１?１　诱导和继代培养基
分别称取蔗糖３０?００g、植物凝胶３?００g、B５培养基１?５５g、WPM 培养基１?２１g,用移液器(管)移取
萘乙酸母液２０?００mL、激动素母液６?５０mL、赤霉素母液３?００mL、柠檬酸母液６?５０mL、抗坏血酸母液
５?００mL,用纯净水定容至１０００mL溶液,调节pH 在５?７０~５?９０后进行分装备用.
７?２?１?２　扩大培养基
分别称取蔗糖４０?００g、B５培养基１?２８g、１/２MS培养基０?９１g、用移液器(管)移取吲哚丁酸母液
２１?００mL、萘乙酸母液１５?００mL、赤霉素母液４?００mL、吲哚乙酸母液３?００mL、６Ｇ苄氨基腺嘌呤母液
３?００mL,用纯净水定容至１０００mL溶液,调节pH 在５?７０~５?９０后进行分装备用.
注:按照量产规模等比例配制.
７?２?２　封口
将配制好的培养基及时盖好器皿口或采用封口膜封口.７?２?３　灭菌７?２?３?１　培养基配制后应尽
快灭菌;１８℃~３０℃温度下应在８h内完成灭菌.７?２?３?２　灭菌方法
不同成分的培养基的灭菌方法如下:
a)　培养基成分中含有植物激素和维生素C等成分时采用过滤除菌等温和方式灭菌;
b) 除了植物激素和维生素C外的培养基成分采用高压蒸汽,灭菌条件为压力０?１０５MPa,灭菌温度
和时间应符合表１的要求.灭菌完成后在超净工作台内将植物激素、维生素C按照配方用量加
入基础培养基.
表１　培养基灭菌条件
培养基容积,mL 灭菌时间,min 灭菌温度,℃
５００~１０００ ２５ １２１(±１)
２０００００~１００００００ ３０ １２２?５(±１)
７?２?４　保存
７?２?４?１　诱导培养基、继代培养基
在超净工作台将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中,凝固后封口、编号,标示配制日期.在防尘、避
光、１８℃~３０℃的常温条件下存放,７d内使用,２℃~８℃低温下存放,１４d内使用.
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７?２?４?２　　扩大培养基
将灭菌后的培养基封口、编号,标示配制日期.在防尘、避光和１８ ℃~３０ ℃的常温条件下存放,７d
内使用,２℃~８℃低温下条件下存放,１４d内使用.
８　外植体前处理
８?１　外植体选择
应选择无腐烂、无病疤的鲜人参根作为外植体.
８?２　外植体消毒
８?２?１　一次消毒
将外植体清洗干净放入超净工作台内,用７５％的乙醇浸泡３０s~１２０s消毒后,用无菌纯净水冲洗外
植体２次~３次.
８?２?２　二次消毒
外植体可选择表２中任一种消毒剂进行浸泡消毒.消毒时间应符合表２的规定.消毒后用无菌水冲
洗外植体４次~６次.
表２　外植体消毒方法
消毒试剂浓度,％ 消毒时间,min
次氯酸钠１~２ ５~３０
过氧化氢１０~１２ ５~１５
次氯酸钙９~１０ ５~３０
９　组织培养
９?１　诱导培养
９?１?１　在超净工作台内将已消毒外植体切成厚度０?２mm~０?５mm、长或宽５?０mm~７?０mm 的不规
则薄片,接种到诱导培养基中.
９?１?２　接种量为１?５g~６?８g/L或１?５g~６?８g/１０００g.
９?１?３　在恒温恒湿箱或培养装置中按以下条件下进行培养:
a)　温度为２２℃~２５℃;
b) 湿度为６０％~８０％;
c) 避光培养２８d~３５d.
９?２　继代培养
９?２?１　在超净工作台内将诱导出新的人参不定根,剪成５?０mm~１０?０mm 小段,转入继代培养基中.
继代次数宜控制在１０代以内.
９?２?２　在恒温恒湿箱或培养装置中按以下条件下进行培养:
a)　温度为２２℃~２５℃;
b) 湿度为６０％~８０％;
c) 避光培养２８d~３５d.
９?３　扩大培养
９?３?１　在超净工作台将继代培养出的人参不定根剪成长度为１０?０mm~２０?０mm 的小段作为单体,每
瓶放置１０个~２０个单体,在装有扩大培养基的恒温振荡培养箱或培养瓶或小型培养装置内培养.
９?３?２　　在恒温振荡培养箱、培养瓶或小型培养装置中按以下条件下培养:
a)　温度为２２℃~２５℃;
b) 转速为８０r/min~１２０r/min;
c) 避光培养２８d~３５d.
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１０　生产培养
１０?１　生产用培养基配制
１０?１?１　按扩大培养基配方,根据生物反应器的体积,在生物反应器中配制成生产用培养基.
１０?１?２　将配制好的生产用培养基在温度１２２?５℃,压力０?１０５MPa、灭菌时间３０min,冷却后备用.
１０?２　接种
１０?２?１　在超净工作台中,将扩大培养的人参不定根剪切成１０?０mm~２０?０mm 的小段.
１０?２?２　可采用火焰接种法或压差接种法接种,操作方法按照附录B执行.
１０?２?３　接种量为３?０g/L~６?０g/L.
１０?３　扩大生产用种子培养
在生物反应器中按以下条件培养:
a)　温度为２２℃~２５℃;
b) 通气量为每升发酵液(培养基)每分钟通无菌空气０?１L~０?５L;
c) 避光培养２８d~４５d.
１０?４　扩大生产培养
１０?４?１　二级培养放大
将１０?３条件下培养好的人参不定根,在原生物反应器中自动剪切为１０?０mm~２０?０mm 的小段,按
照１∶１０的放大比转入下一级生物反应器后,按１０∶３的培养条件继续扩大生产培养２８d~４５d.
１０?４?２　三级培养放大
将１０?４?１培养条件下培养好的人参不定根,按１０?４?１的方法和步骤继续扩大生产培养,获得人参不
定根鲜根.
１１　清洗与干燥
取出不定根,置于网孔直径小于０?１５mm(大于１００目筛)的尼龙网或不锈钢网上,以纯净水冲洗
１min~３min.而后置于７５℃烘箱中烘干至水分含量不高于１２％,或冻干至水分含量不高于１２％,在
密封条件下保存.
１２　信息记录与档案
应对人参组织培养过程的每个阶段,进行详细、准确、及时记录,并及时归档.档案保存期限２ 年
以上.
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附　录　A
(规范性)
母液配制及保存方法
　
母液配制及保存方法详见表A?１.
表A?１　母液配制及保存方法
母液名称配制方法保存温度,－℃ 是否避光
柠檬酸母液　烧杯称取１５g柠檬酸,少量纯净水溶解后倒入１０００mL容量瓶中,用
纯净水定容、分装２~８ 否
抗坏血酸母液　烧杯称取１０g抗坏血酸,少量纯净水溶解后倒入１０００mL容量瓶中,
用去离子水定容、分装－２０ 否
６Ｇ苄氨基腺嘌呤母液　称取２００mg６Ｇ苄氨基腺嘌呤,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入
１０００mL容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
萘乙酸母液　称取２００mg萘乙酸,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入１０００mL
容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
激动素母液　称取６０mg激动素,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入１０００mL
容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
赤霉素母液　称取２００mg赤霉素,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入１０００mL
容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
吲哚乙酸母液　称取２００mg吲哚乙酸,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入１０００mL
容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
吲哚丁酸母液　称取２００mg吲哚丁酸,用２mL~６mL无水乙醇溶解后,倒入１０００mL
容量瓶中,用纯净水定容、分装－２０ 是
　　注:母液２℃~８℃下保存保质期１４d,－２０℃ 保存保质期１２个月.
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附　录　B
(规范性)
生产培养的菌种接种方法
　
B?１　火焰接种法
B?１?１　将要接种的种子液在无菌操作台上集中到一个摇瓶中,瓶口在酒精灯火焰上加热１min,包扎好.
B?１?２　在发酵罐/生物反应器的接种口塞上酒精棉花.
B?１?３　将通入发酵罐生物反应器中的无菌空气的流速减小,打开排气口,降低生物反应器/发酵罐罐内
的压力,但维持一定的正压.
B?１?４　拧松接种口上的塞子以排除罐内空气.
B?１?５　点燃接种口上的酒精棉花,待燃烧１min后,拧开接种口的塞子.
B?１?６　在接种口上的火焰上打开装有种子液的摇瓶,将瓶口在火焰上烧烤.
B?１?７　在火焰上迅速将种子液倒入.
B?１?８　将接种口塞子在火焰上烧烤１min左右,拧紧塞子,熄灭火焰,将发酵罐/生物反应器气量调大至
可保持罐内或反应器内正压.
B?２　压差接种法
B?２?１　接种前在无菌操作台内将所有种子转移到已经灭菌好的容器中,将容器底部放料接口通过阀组
与发酵罐/生物反应器连接,将容器底部管路与生物反应器/发酵罐上的接种管路一起使用蒸汽灭菌.
B?２?２　将生物反应器/发酵罐中的罐压降低,保持正压.
B?２?３　向接种容器内加压,高于生物反应器/发酵罐２０kPa以上.打开容器底部放料阀门与生物反应
器/发酵罐接种阀门,开始接种.
B?２?４　在接种过程中,出口空气管路打开,以保持罐内的压力不会急剧上升,并保持一定的正压.
B?２?５　接种结束后,停止向容器内加压,将容器底部放料阀门与生物反应器接种阀门关闭并使用蒸汽灭
菌连接管路,灭菌结束后再从生物反应器上取下容器.
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