SC/T 3062-2025 生金枪鱼肉种类鉴定方法 实时荧光PCR法

生金枪鱼肉种类鉴定方法实时荧光PCR法总结

1. ​适用范围​

• 适用于生金枪鱼肉产品（马苏、大目、长鳍、蓝鳍、黄鳍金枪鱼）的定性检测。
• 不适用于混合样品或加工后可能破坏DNA的产品。

2. ​规范性引用标准​

• GB/T 1.1-2020：文件结构规范。
• GB/T 6682：实验用水规格。
• GB/T 19495.4：实时荧光PCR检测方法。
• GB/T 27403：实验室质量控制规范。

3. ​核心原理​

• 针对金枪鱼物种特异性SNP位点设计引物和探针，通过实时荧光PCR检测扩增曲线和Ct值判定种类。
• 探针标记FAM荧光基团，部分结合MGB或Eclipse淬灭基团，实现高特异性。

4. ​关键试剂与设备​

• ​试剂​：CTAB、蛋白酶K、dNTPs、BSA、Triton X-100、异丙醇等。
• ​仪器​：实时荧光PCR仪、高速离心机（≥12,000 r/min）、核酸分析仪、灭菌设备等。
• ​引物与探针​：见附录A，针对每种金枪鱼设计特异性序列（如马苏金枪鱼引物MSF/MSR，探针MSP）。

5. ​实验流程​

​样品制备​

• 无菌条件下取1-2g鱼肉，研磨至糜状。

​DNA提取（CTAB法）​​

1. ​裂解​：CTAB裂解液+蛋白酶K消化2小时。
2. ​纯化​：苯酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀DNA，乙醇洗涤后溶解。
3. ​质量评估​：A260/A280比值1.7-1.9，浓度0.01-0.1 μg/μL。

​实时荧光PCR检测​

• ​反应体系​：
  • ​预混液​：预混液A（常规探针法）或B（Cycling探针法，含RNase H）。
  • ​体系组成​：12.5 μL预混液、引物（0.4-0.5 μL）、探针（0.3-0.6 μL）、DNA模板3 μL，补水至25 μL。
• ​程序参数​：
  • 常规程序：95℃ 10min预变性→40循环（95℃ 15s→60℃ 60s）。
  • 蓝鳍/黄鳍：95℃ 30s→40循环（95℃ 5s→55℃ 10s→72℃ 20s）。

​对照设置​

• ​空白对照​：以水替代DNA。
• ​阴性对照​：非目标鱼类DNA。
• ​阳性对照​：目标鱼类DNA。
• ​内参对照​：18S rRNA基因（引物18SF/18SR，探针18SP）。

6. ​结果判定​

• ​质控要求​：
  • 空白/阴性对照：Ct≥40.0，无扩增曲线。
  • 阳性/内参对照：Ct<30.0，典型扩增曲线。
• ​样品判定​：
  • Ct≤35.0：阳性（目标物种存在）。
  • Ct≥40.0：阴性。
  • 35.0<Ct<40.0：重复检测，仍<40则判阳性。

7. ​防污染措施​

• 分区操作（样品处理、PCR配制、扩增区分离）。
• 使用带滤芯吸头，定期清洁设备，避免气溶胶污染。

8. ​附录关键信息​

• ​引物/探针序列​（表A.1）：
  • 马苏金枪鱼：探针MSP（FAM-TTTCATTCTGCCACTGTG-MGB）。
  • 蓝鳍金枪鱼：探针LQP（FAM-cctgga(A)aca-Eclipse，含RNA碱基）。
  • 内参基因：18S rRNA探针（FAM-CCGTTTCTCAGG...-TAMRA）。

9. ​注意事项​

• 混合样品需结合其他方法（如测序）。
• 商业试剂盒需经验证，严格遵循说明书。
• DNA提取质量直接影响检测灵敏度，需严格把控纯度与浓度。

该标准通过高特异性引物探针设计与严格质控流程，为生金枪鱼物种鉴定提供了可靠方法，适用于市场监管、进出口检验及科研领域。