GB 31658.30-2025 食品安全国家标准 动物性食品中二苯乙烯类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　1　范围

　　本文件规定了猪、牛、羊、鸡等动物组织(肌肉、肝脏、肾脏和脂肪)和禽蛋、牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚

　　和己二烯雌酚残留量检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法.

　　本文件适用于猪、牛、羊、鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和脂肪)和禽蛋、牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和己二

　　烯雌酚残留量的测定.

　　2　规范性引用文件

　　下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅

　　该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.

　　GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法

　　3　术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义.

　　4　原理

　　试样中残留的药物经酶解后用乙腈提取(脂肪样品先经乙腈提取,吹干复溶后再酶解),加入正己烷和

　　乙酸乙酯后进行液液液三相体系净化,取中间层氮吹复溶后通过碳酸钠溶液液液萃取和硅胶柱固相萃

　　取进行净化,液相色谱串联质谱仪测定,基质匹配内标法定量.

　　5　试剂与材料

　　以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的一级水.

　　5?1　试剂

　　5?1?1　乙腈(CH3CN):色谱纯.

　　5?1?2　氢氧化钠(NaOH).

　　5?1?3　正己烷(C6H14).

　　5?1?4　乙酸乙酯(CH3COOC2H5).

　　5?1?5　乙酸铵(CH3COONH4).

　　5?1?6　乙酸(CH3COOH).

　　5?1?7　碳酸钠(Na2CO3).

　　5?1?8　βG葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶(βGglucuronidase/arylsulfatase):βG葡萄糖醛苷酸酶4?5U/mL,

　　芳基硫酸酯酶14U/mL,或相当者.

　　5?2　溶液的配制

　　5?2?1　乙酸铵溶液(0?02mol/L):称取乙酸铵1?54g,加水约800mL溶解,用乙酸调节pH 至5?2,加水

　　至1000mL,混匀.

　　5?2?2　10%碳酸钠溶液:取碳酸钠50g,加水450mL使其完全溶解.

　　5?2?3　40%乙腈溶液:取乙腈200mL,加水至500mL,混匀.

　　5?2?4　乙酸乙酯+正己烷(15∶85):取75mL乙酸乙酯、正己烷425mL,混匀.

　　1

　　GB31658?30—2025

　　5?2?5　乙酸乙酯+正己烷(30∶70):取150mL乙酸乙酯、正己烷350mL,混匀.

　　5?3　标准品

　　己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚、己烯雌酚GD8、己烷雌酚GD4 和己二烯雌酚GD6,含量均≥95%,见附

　　录A.

　　5?4　标准溶液的制备

　　5?4?1　标准储备液:取二苯乙烯类药物各标准品适量(相当于有效成分10mg),精密称定,用乙腈溶解并

　　稀释定容于100mL棕色容量瓶,配制成浓度均为100μg/mL的标准储备液.-18 ℃以下保存,有效期

　　12个月.

　　5?4?2　同位素内标储备液:取二苯乙烯类药物各同位素内标标准品适量(相当于有效成分1mg),精密称

　　定,用乙腈溶解并稀释定容于10mL 棕色容量瓶,配制成浓度均为100μg/mL 的同位素内标储备液.

　　-18℃以下保存,有效期12个月.

　　5?4?3　混合标准储备液:分别准确移取己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚标准储备液各0?5 mL 于

　　10mL棕色容量瓶,用乙腈稀释至刻度,配制成浓度为5?0μg/mL的混合标准储备液.-18℃以下保存,

　　有效期12个月.

　　5?4?4　混合内标储备液:分别准确移取己烯雌酚GD8、己烷雌酚GD4 和己二烯雌酚GD6 标准储备液各0?5mL

　　于10mL棕色容量瓶,用乙腈稀释至刻度,配制成浓度为5?0μg/mL的混合内标储备液.-18℃以下保存,

　　有效期12个月.

　　5?4?5　混合内标工作液:准确移取混合内标储备液0?2mL于10mL棕色容量瓶中,用乙腈稀释至刻度.

　　该溶液中各内标浓度为100μg/L.现用现配.

　　5?4?6　混合标准工作液:准确移取混合标准储备液、混合内标工作液适量,用40%乙腈溶液稀释成浓度

　　为1?0μg/L、2?0μg/L、5?0μg/L、20μg/L、50μg/L和200μg/L的系列标准工作溶液,每一标准工作溶

　　液含各内标浓度均为10μg/L.现用现配.

　　5?5　材料

　　5?5?1　硅胶固相萃取小柱:500mg/3mL,或相当者.

　　5?5?2　针头式过滤器(通用型滤膜):尼龙材质,孔径0?22μm,或性能相当者.

　　6　仪器和设备

　　6?1　液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源.

　　6?2　分析天平:感量0?00001g和0?01g.

　　6?3　氮吹仪.

　　6?4　恒温振荡器.

　　6?5　固相萃取装置.

　　6?6　离心管:聚丙烯塑料离心管,50mL.

　　6?7　离心机:9000r/min或以上.

　　6?8　pH 计.

　　6?9　涡旋混合器.

　　7　试样的制备与保存

　　7?1　试样的制备

　　取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并均质.

　　取新鲜或解冻的空白或供试牛奶,混合均匀.

　　取适量新鲜或冷藏的空白或供试禽蛋,去壳后混合均匀.

　　a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;

　　2

　　GB31658?30—2025

　　b) 取均质后的空白样品,作为空白试样;

　　c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.

　　7?2　试样的保存

　　-18℃以下保存.

　　8　测定步骤

　　8?1　提取

　　8?1?1　肌肉、肝脏、肾脏、鸡蛋、牛奶

　　称取试料(5±0?05)g,于50mL离心管,准确加入混合内标工作液100μL,混合15s,加乙酸铵溶

　　液10mL、βG葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL,涡旋1 min,(37±1)℃振荡酶解12h.酶解后以

　　9000r/min离心2min,收集提取液,然后在残渣中加入乙腈10 mL,涡旋1 min,6000r/min离心

　　2min,取乙腈层,残渣再加入乙腈10mL,重复提取,合并提取液.

　　8?1?2　脂肪

　　称取试料(5±0?05)g,准确加入混合内标工作液100μL,混合15s,加入正己烷15mL,涡旋1min,

　　再加入乙腈10mL后涡旋1min,6000r/min离心2min,取乙腈层,样品中再加入乙腈10mL,重复萃

　　取,合并乙腈层,50 ℃氮气吹干,加入乙酸铵溶液10mL、βG葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL,涡旋

　　1min,(37±1)℃振荡酶解12h,后续操作步骤同8?1?1中酶解后处理步骤.

　　8?2　净化

　　提取液中加入正己烷8mL和乙酸乙酯2mL,涡旋1min,6000r/min离心2min,取中间乙腈层,

　　50℃氮吹至干,用乙酸乙酯10mL溶解残渣,转移至50mL离心管,加入10%碳酸钠溶液2mL,涡旋混

　　合1min,以6000r/min离心2min,弃去下层水相,再加入10%碳酸钠溶液2mL,重复上述步骤后将乙

　　酸乙酯转移至10mL试管,50℃氮气吹干.

　　用乙酸乙酯+正己烷(15∶85)溶液2mL溶解残渣,转移至已依次用正己烷5mL、乙酸乙酯5mL活

　　化并抽干处理后的硅胶柱上,待溶液过柱后再用正己烷5mL淋洗,弃去正己烷淋洗液,抽干柱子,用乙酸

　　乙酯+正己烷(30∶70)溶液5mL洗脱,收集洗脱液,50℃氮气吹干,用40%乙腈溶液1?0mL溶解残渣,

　　涡旋混匀,0?22μm 滤膜过滤,供液相色谱串联质谱测定.

　　8?3　基质匹配标准曲线的制备

　　取空白试料依次按8?1和8?2处理,50 ℃水浴氮气吹干,加入混合标准工作液1?0mL溶解残渣,

　　过0?22μm 滤膜,得内标浓度均为10μg/L 的1?0μg/L、2?0μg/L、5?0μg/L、20μg/L、50μg/L 和

　　200μg/L的系列基质匹配标准工作溶液,供液相色谱串联质谱测定.以定量离子对峰面积与内标物

　　离子对峰面积的比值为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标,绘制基质匹配标准曲线.求回归方程和相关

　　系数.

　　8?4　测定

　　8?4?1　液相色谱参考条件

　　a)　色谱柱:C18色谱柱(100mm×2?1mm,1?7μm),或相当者;

　　b) 流动相:A 为水,B为乙腈,梯度洗脱程序见表1;

　　c) 流速:0?3mL/min;

　　d) 柱温:35℃;

　　e) 进样量:10μL.

　　表1　梯度洗脱程序

　　时间

　　min

　　A

　　%

　　B

　　%

　　0 70 30

　　1?0 70 30

　　3

　　GB31658?30—2025

　　表1 (续)

　　时间

　　min

　　A

　　%

　　B

　　%

　　2?5 60 40

　　4?5 60 40

　　5?0 10 90

　　6?0 10 90

　　6?1 70 30

　　7?5 70 30

　　8?4?2　质谱参考条件

　　a)　离子源:电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式:负离子模式;

　　c) 检测方式:多反应监测(MRM);

　　d) 毛细管电压:2?5kV;

　　e) RF透镜电压:0?5V;

　　f) 离子源温度:150℃;

　　g) 脱溶剂气温度:600℃;

　　h) 锥孔气流速:50L/h;

　　i) 脱溶剂气流速:1000L/h;

　　j) 倍增器电压:650V;

　　k) 二级碰撞气:氩气;

　　l) 定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值见表2.

　　表2　定性离子对、定量子离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值

　　中文名称

　　定性离子对

　　m/z

　　定量离子对

　　m/z

　　锥孔电压

　　V

　　碰撞能量

　　eV

　　己烯雌酚267?1>237?1

　　267?1>222?2 267?1>222?2 40 24

　　35

　　己烷雌酚269?2>134?1

　　269?2>119?1 269?1>134?1 34 14

　　36

　　己二烯雌酚265?0>93?0

　　265?0>249?1 265?0>93?0 40 26

　　24

　　己烯雌酚GD8 275?2>228?2 275?2>228?2 40 35

　　己烷雌酚GD4 273?1>136?2 273?1>136?2 34 18

　　己二烯雌酚GD6 271?0>95?0 271?0>95?0 40 24

　　8?4?3　测定法

　　8?4?3?1　定性测定

　　在同样测试条件下,试料溶液中待测物质的保留时间与相应内标物保留时间的比值与标准溶液中待

　　测物质的保留时间与相应内标物保留时间的比值相对偏差在1?0%以内;且检测到的离子的相对丰度应

　　当与浓度相当的基质匹配标准工作溶液相对丰度一致,其允许偏差为±40%.

　　8?4?3?2　定量测定

　　取试料溶液和基质匹配标准工作溶液,做单点或多点校准,内标法计算.基质匹配标准工作溶液及试

　　样溶液中目标药物的特征离子质量色谱峰峰面积均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱质谱条件

　　下,羊肉添加样品液相色谱串联质谱多反应监测(MRM)色谱图见附录B.

　　8?5　空白试验

　　取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的操作步骤进行平行操作.

　　4

　　GB31658?30—2025

　　9　结果计算和表述

　　试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式(1)计算.

　　X =

　　Ai ×A′is×Cs×Cis×V

　　Ais×As×C′is×m ????????????? (1)

　　式中:

　　X ———试样中二苯乙烯类药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);

　　Ai ———试料溶液中二苯乙烯类药物的峰面积;

　　A′is———基质匹配标准溶液中二苯乙烯类药物内标的峰面积;

　　Cs ———基质匹配标准溶液中二苯乙烯类药物浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

　　Cis ———试料溶液中二苯乙烯类药物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

　　V ———定容体积的数值,单位为毫升(mL);

　　Ais ———试料溶液中二苯乙烯类药物内标的峰面积;

　　As ———基质匹配标准溶液中二苯乙烯类药物的峰面积;

　　C′is———基质匹配标准溶液中二苯乙烯类药物内标浓度的数值,单位为微克每升(μg/L);

　　m ———试料质量的数值,单位为克(g).

　　己烯雌酚结果计算为顺反式2个异构体之和.

　　10　检测方法的灵敏度、准确度和精密度

　　10?1　灵敏度

　　本方法在猪、牛、羊、鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和脂肪)和禽蛋、牛奶中的检出限为0?50μg/kg,定量限

　　为1?0μg/kg.

　　10?2　正确度

　　本方法在1μg/kg~50μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%~120%.

　　10?3　精密度

　　本方法的批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤20%.

　　5

　　GB31658?30—2025

　　附　录　A

　　(资料性)

　　二苯乙烯类药物的中英文名称、分子式、CAS号

　　二苯乙烯类药物的中英文名称、化学分子式和CAS号见表A?1.

　　表A?1　二苯乙烯类药物的中英文名称、化学分子式、CAS号

　　中文名称英文名称化学分子式CAS号

　　己烯雌酚Diethylstibestrol C18H20O2 6898G97G1

　　己烷雌酚Hexestrol C18H22O2 84G16G2

　　己二烯雌酚Dienestrol C18H18O2 84G17G3

　　己烯雌酚GD8 DiethylstibestrolGd8 C18H12D8O2 91318G10G4

　　己烷雌酚GD4 HexestrolGd4 C18H18D4O2 1189950G25G1

　　己二烯雌酚GD6 DienestrolGd6 C18H12D6O2 91297G99G3

　　6

　　GB31658?30—2025

　　附　录　B

　　(资料性)

　　羊肉添加样品液相色谱串联质谱多反应监测(MRM)色谱图

　　羊肉添加样品液相色谱串联质谱多反应监测(MRM)色谱图见图B?1.

　　图B?1　羊肉添加样品(添加浓度1?0μg/kg,内标添加浓度2?0μg/kg)

　　液相色谱串联质谱多反应监测(MRM)色谱图

　　7