DB37/T 4879-2025 大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法

　　山东省地方标准

　　DB37/T 4879—2025

　　大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法

　　Method for the separation and identification of epiphytic and endophytic bacteria of macroalgae

　　2025 - 07 - 29发布

　　2025 - 08 - 29实施

　　山东省市场监督管理局发布

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由山东省海洋局提出并组织实施。

　　本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。

　　1 范围

　　本文件描述了大型海藻附生和内生细菌分离纯化、鉴定和保藏的方法。

　　本文件适用于大型海藻附生和内生细菌的分离鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 30744—2014 深海微生物样品前处理技术规范

　　DB37/T 4092—2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　大型海藻 macroalgae

　　肉眼可见的、绝大多数是多细胞的丝状体、膜状体、管状体或叶状体植物。

　　注：主要包括红藻、绿藻和褐藻。

　　附生细菌 epiphytic bacteria

　　定殖于大型海藻藻体表面的细菌。

　　内生细菌 endophytic bacteria

　　生长在大型海藻藻体内部的细菌。

　　4 试剂与耗材

　　试剂

　　4.1.1 无菌1×PBS缓冲液：2 mM KH2PO4，0.137 M NaCl，10 mM Na2HPO4，2.7 mM KCl。

　　4.1.2 陈海水：天然海水避光保存三周及以上，使用时经孔径0.45 μm滤膜过滤的滤液。

　　4.1.3 超纯水：符合GB/T 6682—2008中一级水要求。

　　4.1.4 酒精：75%乙醇。

　　4.1.5 次氯酸钠溶液：浓度2.5%。

　　4.1.6 生理盐水：0.9%的NaCl溶液。

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　　经121 ℃，20 min灭菌处理。

　　4.1.7 保种液。

　　向配置好的0.9%的NaCl溶液中添加甘油，至终浓度为15%(V/V)，将配置好的保种液置于封闭容器储存。121 ℃，20 min灭菌处理。

　　4.1.8 Zobell 2216E培养基：5.0 g蛋白胨，1.0 g酵母膏，0.01 g FePO4，20.0 g琼脂(固体培养基添加)，1 000 mL陈海水，pH7.4～7.8。

　　121 ℃灭菌20 min。

　　4.1.9 无菌液体石蜡。

　　耗材

　　4.2.1 细菌基因组DNA提取试剂盒(市售)。

　　4.2.2 枪头：材料为聚丙烯的微量加样器套头，规格为0.2 mL、1.0 mL和5.0 mL。

　　4.2.3 冻存管：材料为聚丙烯，或其它可耐121 ℃高温和液氮的塑料管，容积大于或等于2.5 mL。

　　4.2.4 其他生物实验常用耗材：纱布、封口膜。

　　5 仪器与设备

　　生化培养箱：培养室温度能在0 ℃～60 ℃范围内调节。

　　振荡培养箱：培养室温度能在0 ℃～60 ℃范围内调节，转速能在0 r/min～300 r/min范围内调节。

　　电子天平：精度为0.01 g。

　　玻璃试管：直径×长度为18 mm×180 mm的平口玻璃试管和直径×长度为15 mm×150 mm的平口玻璃试管。

　　锥形瓶：容量为250 mL的广口玻璃锥形瓶。

　　脉冲场电泳仪系统：最高输出电压350 V，电压连续可调，最大输出电流0.5 A，转换范围50 ms到 18 h，转换角度为0°～360°，包括电泳仪、水浴循环仪和电冰槽。

　　其他生物实验常规仪器：超净工作台、漩涡振荡器、高压灭菌锅和酒精灯等。

　　6 藻类样品采集与处理

　　样品采集

　　采用随机抽样的方法，选取生长状态良好、长势一致的藻类样本，每株样本的重量约为30 g;样本处理前应置于原位海水中或在4 ℃冰箱中保存(不超过24 h)，2 h内处理分析。

　　用121 ℃，20 min灭菌过滤后的海水洗涤清除藻体表面附加的沙粒、沉积物、食草动物和杂藻，备用。

　　样品处理

　　6.2.1 附生细菌样品的处理

　　称取藻体样品2.00 g(精确至0.01 g)，置于250 mL无菌锥形瓶中，加入18 mL无菌1×PBS缓冲液，用灭菌封口膜封口，使用振荡培养箱(温度25 ℃，转速200 r/min)振荡30 min，获取藻体表面分离的附生细菌悬液。

　　6.2.2 内生细菌样品的处理

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　　6.2.2.1 取洗净的藻体样品2.00 g放入烧杯中，先用75%乙醇浸泡，后用2.5%的次氯酸钠溶液浸泡，浸泡时间根据藻体种类及实际情况确定，浸泡后的藻体使用超纯水清洗5次以上。为了确定除菌是否彻底，可将最后一次冲洗液接种在2216E平板上，若无菌落生长则认为藻体表面除菌彻底。藻体表面除菌效果记录表，见附录A。

　　6.2.2.2 取 6.2.2.1中表面除菌彻底的藻体置于无菌研钵中，加入18 mL生理盐水研磨，获取内生细菌悬液，备用。

　　7 细菌样品的分离与纯化

　　细菌样品的分离

　　7.1.1 附生细菌

　　7.1.1.1 取1 mL附生细菌悬液(6.2.1)，加入生理盐水进行10倍系列稀释，获得稀释倍数分别为10倍、100倍和1 000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。

　　7.1.1.2 取6.2.1和7.1.1.1制备的样品各100 μL，分别涂布于Zobell 2216E固体培养基上。25 ℃ 培养 72 h，每24 h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录B。

　　7.1.2 内生细菌

　　7.1.2.1 取1 mL内生细菌悬液(6.2.2.2)，加入生理盐水进行10倍系列稀释，获得稀释倍数10倍、100倍和1 000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。

　　7.1.2.2 取6.2.2.2和7.1.2.1制备的样品各100 μL，分别涂布于Zobell 2216E固体培养基上。25 ℃ 培养72 h，每24 h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录B。

　　细菌样品的纯化

　　7.2.1 根据菌落生长状况及菌落形态特征，选择合适稀释度(每培养皿30个～300个菌落)的培养皿，进行单菌落挑取，划线纯化。方法如下：

　　a) 菌落数在30左右的培养皿，每个菌落都挑取，进行划线纯化;

　　b) 菌落数在50左右的培养皿，挑取1/2个培养皿上的单菌落，进行划线纯化;

　　c) 菌落数在100左右的培养皿，挑取1/4个培养皿上的单菌落，进行划线纯化;

　　d) 菌落数大于100的培养皿，挑取特殊的其它培养皿上没有出现过的菌落，进行划线纯化。

　　7.2.2 观察划线菌落形态特征是否一致，如不一致，再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养菌株，并填写附录B菌落形态特征统计表。

　　8 藻类细菌鉴定与保藏

　　细菌的鉴定

　　8.1.1 DNA提取

　　将获得的纯培养菌株(7.2.2)接种于斜面培养试管，培养获得适龄斜面菌苔，加入4.5 mL灭菌后的生理盐水通过漩涡振荡器振荡得到菌悬液。按照GB/T 30744相关规定，进行基因组DNA提取。

　　8.1.2 细菌基因组16S rRNA基因扩增

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　　采用细菌通用的正向引物338F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和反向引物806R(3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’)对16S rRNA的V3+V4区进行扩增。

　　8.1.3 PCR产物电泳检测

　　对扩增所得的PCR产物进行电泳检测，按照DB37/T 4092—2020相关规定执行。

　　8.1.4 PCR产物测序及序列比对

　　对检测合格的PCR产物进行Sanger测序，测序结果与模式菌数据库EzBioCloud进行序列比对，选取序列相似度最高的前10个菌种的序列，与待鉴定菌的序列通过MEGA中邻接法、最大似然法和最小进化法三种方法构建系统进化树，将细菌鉴定到种。

　　细菌的保藏

　　8.2.1 石蜡油封存

　　在斜面培养物上，加封一层(2 cm～3 cm)无菌液体石蜡，然后置于15 ℃培养箱中保存。填写《菌株信息记录表》，见附录C。

　　8.2.2 冷冻保存

　　将获得的纯培养菌株(7.2.2)接种于斜面培养试管，获得适龄斜面菌苔，加入4.5 mL灭菌后的保种液，通过漩涡振荡器振荡斜面培养试管，将细菌培养物振荡至保种液中，或直接向液体培养物中添加甘油，至终浓度为15%(V/V)。随后，转移至冻存管中，做好标记，保存于-20 ℃冰箱或经预冷冻(-20 ℃，20 min;-40 ℃，20 min～30 min;-60 ℃，20 min～30 min)处理后长期保存于超低温(-80 ℃)条件下。保藏的菌种不能反复冻融，如取用保藏菌株，需及时重新保藏菌种。填写附录C菌株信息记录表。

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　　附录A (资料性) 大型海藻表面除菌效果记录表

　　大型海藻表面除菌效果记录表见表A.1。

　　表A.1 大型海藻表面除菌效果记录表

　　浸泡时间

　　75%酒精浸泡

　　3 min

　　5 min

　　2.5%次氯酸钠浸泡

　　板1

　　板2

　　板3

　　板1

　　板2

　　板3

　　3 min

　　5 min

　　10 min

　　15 min

　　注：“+”代表有菌落长出;“-”代表无菌落

　　记录者 校对者 审核者

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　　附录B (资料性) 菌落形态特征记录表

　　菌落形态特征记录表见表B.1。

　　表B.1 菌落形态特征记录表

　　菌种编号

　　颜色

　　大小

　　形状

　　质地

　　有无光泽

　　是否湿润

　　是否透明

　　是否凸起

　　培养时间

　　记录人

　　记录时间

　　记录者 校对者 审核者

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　　附录C (资料性) 菌株信息记录表

　　菌株信息记录表见表C.1。

　　表C.1 菌株信息记录表

　　大型海藻信息

　　物种名

　　编号

　　采集日期

　　采集地点

　　样品状态

　　采集人

　　菌株16S rDNA鉴定及保藏信息

　　菌株编号

　　最相似物种

　　相似度(%)

　　保藏时间

　　保藏方式

　　保藏孔位

　　记录者 校对者 审核者

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　　参考文献

　　[1] HJ 442.9 近岸海域环境监测技术规范 第九部分 近岸海域应急与专题监测