DB15/T 4169-2025 奶绵羊常规及性控冷冻精液生产技术规程

　　内蒙古自治区地方标准

　　DB15/T 4169—2025

　　奶绵羊常规及性控冷冻精液生产技术规程

　　Code of practice for production of dairy sheep frozen conventional semen and sexed-semen

　　2025-08-15发布

　　2025-09-15实施

　　内蒙古自治区市场监督管理局 发布

　　DB15/T 4169—2025

　　I

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由内蒙古大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心提出。

　　本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。

　　本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古农业大学、内蒙古乌兰察布市畜牧工作站、呼和浩特市农牧技术推广中心、内蒙古乐科生物技术有限公司、河套学院、内蒙古丰东知盈牧业科技有限公司、内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司、内蒙古自治区农牧业科学院、蒙天然牧业科技发展有限公司。

　　本文件主要起草人：王申元、武志红、张立、刘永斌、李喜和、张立果、武霞霞、董志岷、寇慧娟、苏小虎、宋永利、张滕、赵高平、朱怡静、张功、包花拉、刘光男、刘建宁、莫德日乐吐、刘权、刘信、阿仑、丁瑞、周扬、杨燕燕、萨仁格勒。

　　1 范围

　　本文件规定了奶绵羊常规及性控冷冻精液生产的器具准备与消毒、溶液配制、精液采集、精液处理、精液冷冻、冷冻精液质量检验、贮存和运输要求。

　　本文件适用于奶绵羊常规及性控冷冻精液的生产。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 20557 山羊冷冻精液

　　GB/T 31581 牛性控冷冻精液生产技术规程

　　NY/T 3186 羊冷冻精液生产技术规程

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　奶绵羊 dairy sheep

　　以产奶为主要生产方向的绵羊品种。

　　顶体完整率 acrosome integrity rate

　　顶体完整的精子数量占所观察精子数量的百分比。

　　质膜完整率 plasma membrane integrity

　　质膜完整的精子数量占所观察精子数量的百分比。

　　冷冻精液 frozen semen

　　经特殊方法处理并超低温冷冻后在液氮中(-196 ℃)长期保存的精液。

　　4 器具准备与消毒

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　　2

　　按照NY/T 3186要求执行。

　　5 溶液配制 精子稀释液

　　按照附录A执行。 其它溶液

　　精子分离缓冲液、精子荧光染色液、食品红染色液、精子染色原液和精子收集液按照GB/T 31581要求配制。

　　6 精液采集

　　按照NY/T 3186要求执行。

　　7 精液处理 精液品质检查

　　7.1.1 鲜精外观

　　正常的精液色泽为乳白色或淡黄色，质地均匀、无异物。

　　7.1.2 鲜精密度

　　精子密度测定仪检测鲜精密度，合格鲜精精子密度≥8×108个/mL。

　　7.1.3 鲜精活力

　　活力检查按照GB 20557要求执行，合格精子活力≥70%。 常规精液稀释

　　7.2.1 稀释密度

　　精液稀释解冻后每支0.25 mL细管中前进运动精子数≥1.5×107个。

　　7.2.2 稀释步骤

　　评估合格的精液依据最终精子密度为每毫升不小于2×108个计算出稀释后总体积。选用合适体积的器皿加1倍体积37 ℃预热的TrisA液稀释;37 ℃水浴10 min后加2倍体积的TrisA液稀释;再水浴10 min后加TrisA至总体积的一半稀释，水浴10 min。TrisA稀释后的精液封口后置于含37 ℃水的250 mL烧杯中，在4 ℃低温柜中平衡2 h，加冷藏的TrisB液至总体积，再在4 ℃低温柜中平衡1 h，待分装。 性控精液分离、稀释

　　7.3.1 精子分离

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　　评估合格的精液使用TrisA液按体积1:1等温稀释后，置于18 ℃～20 ℃的环境下保存、待用。精子分离步骤按照GB/T 31581要求执行。分离精子收集液中每毫升添加0.01 mg～0.05 mg的过氧化氢酶和0.2 mg～0.5 mg的谷胱甘肽还原酶。

　　7.3.2 分离精子稀释

　　分离后的精子收集液在4 ℃条件下平衡90 min，然后4 ℃、850 g离心20 min，去除上清液，用含20%卵黄的TrisA液稀释精子，之后添加等体积的TrisB液，平衡20 min;然后用等体积的TrisA液和TrisB液将最终精子密度调整为每毫升≥1×107个。

　　7.3.3 稀释密度

　　精液稀释解冻后每支0.25 mL细管中前进运动精子数≥1×106个。 精液分装与标识

　　平衡后的精液在4 ℃条件下用无菌0.25 mL细管灌装、封口、印字，细管上横向打印生产单位代号、品种、种公羊号、生产日期或批号、是否性控等标识信息(按照附录B执行)。

　　8 精液冷冻

　　在4 ℃条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上，然后放入程序控制冷冻仪中。冷冻程序设置为：4 ℃～-10 ℃时降温速率5 ℃/min;-10 ℃～-100 ℃时降温速率60 ℃/min;-100 ℃～ -140 ℃时降温速率为20 ℃/min。其他操作按照程序控制冷冻仪操作规程执行，冷冻结束后进行置液氮中包装、保存。

　　9 冷冻精液质量检验 精液解冻

　　水浴37 ℃恒温后，迅速从贮存罐中取出预留冻精，37 ℃水浴中45 s;取出细管用无菌吸水纸擦拭干净，剪掉没有海绵塞一端封口，用推针推动海绵塞，将精液推入1.5 mL离心管中，待检。 解冻后合格标准

　　9.2.1 细管外观

　　细管无裂痕，封口严密，标识清晰。

　　9.2.2 活力

　　解冻后精子活力≥30%。

　　9.2.3 精子畸形率

　　精子畸形率≤20%。检测方法按照GB 20557要求执行。

　　9.2.4 细菌数

　　细菌数≤800个/剂。检测方法按照GB 20557要求执行。

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　　9.2.5 顶体完整率

　　顶体完整率≥45%。检测方法按照附录C执行。

　　9.2.6 质膜完整率

　　质膜完整率≥35%。检测方法按照附录D执行。

　　10 贮存和运输

　　按照GB 20557要求执行。

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　　A

　　A 附录A (规范性) 奶绵羊精液稀释液配制

　　A.1 试剂纯度要求 试剂纯度要求 试剂纯度要求

　　所有试剂纯度达到AR级以上。

　　A.2 1000 mL TrisAmL TrisA mL TrisA 液

　　Tris 27.1 g、柠檬酸14 g、果糖10 g、M199 20 mL、大豆卵磷脂10 g、白藜芦醇0.02 g、青链霉素各10000 IU，加超纯水至1000 mL，调节溶 调节溶 液pH值到6.8，然后用0.22 ㎛的滤器过滤除菌。

　　A.3 100 mL TrisB mL TrisB mL TrisB 液

　　TrisA液90 mL、甘油10 mL，磁力搅拌混匀，然后用0.22 ㎛的滤器过滤除菌。

　　A.4 250 mL 250 mL含 20 %卵黄的 TrisA TrisATrisA液

　　取 TrisA TrisA 液 199 mL 199 mL199 mL ，51 mL 51 mL51 mL51 mL卵黄液，磁力搅拌 卵黄液，磁力搅拌 卵黄液，磁力搅拌 卵黄液，磁力搅拌 15 min 15 min后置 4 ℃条件下静置 ℃条件下静置 ℃条件下静置 12 h 12 h12 h，去除表层卵脂， ， 去除表层卵脂， 去除表层卵脂， 去除表层卵脂液体在 液体在 3850 g 3850 g 的条件离心 的条件离心 的条件离心 10 min ，取上清用 ，取上清用 ，取上清用 0.22 0.22 0.22 ㎛的滤 器过 滤除菌。 滤除菌。 滤除菌。

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　　B

　　B 附录B (规范性) 奶绵羊细管冷冻精液标记方法

　　细管冷冻精液标识由5个部分组成，每部分之间空开2个字符位置，排列顺序由棉塞端到封口端依次为：

　　生产单位代号 性控标记 品种代号 生产日期 奶绵羊号

　　2～4个字符 七个字符 两个字符 八个字符 八个字符

　　第一部分以公司缩写代号为准;第二部分“性控标记”标识：“N-Sexed”为常规冻精，“Sexed-X”为雌性，“Sexed-Y”为雄性;第三部分品种代号以 GB 20557为依据;第四部分公羊号取该奶绵羊身份证号码后八个字符;第五部分冻精生产日期八位数按年、月、日次序排列。每部分之间空2个字符。标记的字迹应清晰易认。

　　示例：

　　FDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY NFDZY N-Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008Sexed EF 20230120 01252008

　　棉塞封口端 超声波封口端

　　FDZY为生产单位代号，N-Sexed为常规冻精，若为Sexed-X则为雌性标识代号，EF为东弗里升奶绵羊的英文品种代号，20230120为冻精生产日期，01252008为该公羊身份证号码。

　　第一部分

　　第二部分

　　第四部分

　　第三部分

　　第五部分

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　　7

　　C

　　C 附录C (规范性) 奶绵羊冷冻精液精子顶体完整率检测方法

　　C.1 器材、试剂 器材、试剂

　　荧光显微镜、烘片机、多聚赖氨酸粘附性载玻片、HSOF、PBS、4%多聚甲醛、FITC-PSA、DAPI、甘油。

　　C.2 操作步骤 操作步骤

　　C.2.1 冻精准备 冻精准备

　　解冻冻精于1.5 mL离心管中，加入1 mL HSOF并混匀;1500 rpm离心5 min，弃上清液，留约20 μL。

　　C.2.2 固定

　　加入适量的PBS重悬精子，并向其中加入4%多聚甲醛对精子进行固定，固定约30 min。

　　C.2.3 洗涤

　　向精液中加入PBS 1 mL，1500 rpm离心5 min洗涤2次以除去精浆、多聚甲醛等，洗涤后加入1 mL PBS重悬精子。

　　C.2.4 涂片染色 涂片染色

　　取10 μL精液均匀涂于多聚赖氨酸粘附性载玻片上，并将其放于烘片机上干燥;加10 μL FITC-PSA对精子进行避光染色15 min;用超纯水缓慢洗涤玻片并干燥;加5 μL DAPI染色液避光染色5 min。

　　C.2.5 洗涤干燥 洗涤干燥

　　用超纯水缓慢洗涤玻片，放烘片机上干燥，并用PBS与甘油的混合物封片。

　　C.2.6 镜检

　　荧光显微镜下观察，共计数至少200个精子来统计冻后精子顶体完整率，若精子头部均染成明亮的绿色荧光且均匀即顶体完整(AI);已发生顶体反应(AR)的精子仅在赤道带出现荧光染色，或者头部无绿色荧光。

　　C.2.7 计算

　　所检冻精的顶体完整率按下式计算：

　　C=C1/S×100% …………………………………(C.1)

　　式中：

　　C——顶体完整率(%);

　　C1——顶体完整的精子数，单位为个;

　　S——观察的总精子数，单位为个。

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　　D

　　D 附录D (规范性) 奶绵羊冷冻精液精子质膜完整率检测方法

　　D.1 器材、试剂 器材、试剂

　　荧光显微镜、恒温水浴锅、HSOF、低渗溶液、PBS。

　　D.2 操作步骤 操作步骤

　　D.2.1 冻精准备 冻精准备

　　解冻冻精于1.5 mL离心管中，向管中加1 mL HSOF并混匀，1500 rpm离心5 min，加适量的PBS重悬精子，使精子的密度达到1×106个/mL。

　　D.2.2 低渗溶液处理 低渗溶液处理 低渗溶液处理

　　吸取200 μL精液加到1 mL 0.45%氯化钠溶液中，38 ℃水浴30 min。

　　D.2.3 封片

　　取10 μL精液滴到载玻片上并盖上盖玻片。

　　D.2.4 镜检

　　自然干燥后在显微镜下观察，每个视野观察200个以上的精子，若尾部蜷曲为质膜完整精子，尾部无变化或其它形态为质膜不完整精子。

　　D.2.5 计算

　　所检冻精的质膜完整性按下式计算：

　　D=D1/S×100 …………………………………(D.1)

　　式中：

　　D——质膜完整率(%);

　　D1——质膜完整的精子数，单位为个;

　　S—— 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。 观察的总精子数，单位为个。