NY/T 4524-2025 三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法
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- 标准类型：农牧渔类
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-06-08
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资料介绍
以下是《NY/T 4524-2025 三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法》的详细内容总结：
一、标准基本信息
- 标准号：NY/T 4524-2025
- 名称：三七种子种苗腐皮镰刀菌检测方法
- 发布日期：2025年5月1日
- 归口单位：农业农村部种植业管理司
- 起草单位：中国农业科学院植物保护研究所、文山七麟三七科技有限公司
二、适用范围
适用于三七（Panax notoginseng）种子和种苗中腐皮镰刀菌（Fusarium solani）的检测，包括：
- 形态学检测（第一章）
- PCR检测（第二章）
- 实时荧光定量PCR检测（第三章）
三、腐皮镰刀菌基本信息
- 分类：瘤座孢科镰刀菌属。
- 形态特征：
- 菌落白色、细密绒毛状，菌丝有隔分枝。
- 分生孢子分两种：小型孢子卵圆形至柱形（1-2隔膜）；大型孢子镰刀形或长柱形（多横隔）。
- 危害：
- 侵染三七根茎，导致根腐病（根部褐变腐烂、维管束变色、植株萎蔫死亡）。
- 寄主范围广（豌豆、马铃薯、辣椒、三七等）。
四、样品制备
1. 种子样品
- 外部检测：
- 随机取100粒种子，无菌水振荡30分钟 → 离心浓缩 → 梯度稀释。
- 内部检测：
- 种子用1%次氯酸钠消毒10分钟 → 无菌水冲洗 → 研磨成组织液。
- 保存：未检样品需15–18℃暂存。
2. 种苗样品
- 取根茎组织2–3g → 75%乙醇或1%次氯酸钠表面消毒 → 无菌水洗净 → 研磨成组织液。
- 保存：4℃冷藏。
五、检测方法
第一章 形态学检测
- 培养基：
- PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂）用于种子检测。
- Komada培养基（含选择性抑制剂）用于种苗检测。
- 检测步骤：
- 种子外部：稀释液涂布PDA平板 → 25℃暗培养3–5天。
- 种子内部：消毒种子摆放PDA平板 → 25℃暗培养5–7天。
- 种苗：研磨液涂布Komada平板 → 28℃暗培养3–5天。
- 结果判定：分离真菌纯化后，镜检菌落及孢子形态符合腐皮镰刀菌特征（附录A）。
第二章 PCR检测
- 引物：841-2F/841-2R（扩增片段175 bp）。
- DNA提取：
- CTAB法：裂解→酚-氯仿抽提→乙醇沉淀。
- 试剂盒法：按说明书操作。
- PCR体系（25 μL）：
- 模板DNA 2 μL + 2×Taq Mix 12.5 μL + 引物各1 μL + ddH₂O 8.5 μL。
- 扩增程序：95℃ 5 min → 35循环（95℃ 1 min → 60℃ 1 min → 72℃ 1 min）→ 72℃ 10 min。
- 结果判定：电泳检测175 bp条带（附录B），空白/阴性对照无条带，阳性对照有条带。
第三章 实时荧光定量PCR（qPCR）
- 体系（20 μL）：
- 模板DNA 1 μL + 2×qPCR Mix 10 μL + 引物各0.6 μL + ddH₂O 7.8 μL。
- 程序：95℃ 60 s → 40循环（95℃ 15 s → 60℃ 15 s → 72℃ 30 s）。
- 标准曲线：以10⁵–10¹ copies/μL质粒建立线性方程（R²≥0.992）。
- 结果判定（附录C）：
- 阳性：Ct值<30且熔解曲线单一峰（Tm=85.5℃）。
- 可疑：28<Ct<30时需复检。
六、关键质量控制
- 对照设置：
- 空白对照（无菌水）、阴性对照（非目标菌DNA）、阳性对照（腐皮镰刀菌DNA）。
- 重复性：
- 所有检测需3次重复。
- 判定规则：
- PCR/qPCR需对照结果符合预期（如空白无扩增）。
七、附录内容
- 附录A：腐皮镰刀菌形态特征及三七发病症状（图A.1–A.2）。
- 附录B：PCR电泳图（目标条带175 bp）。
- 附录C：qPCR熔解曲线（单一峰）和标准曲线（线性关系）。
八、规范性引用文件
- GB/T 1.1-2020《标准化工作导则》
- GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》
总结：该标准系统规范了三七种子种苗中腐皮镰刀菌的三种检测方法，涵盖从样品制备、实验操作到结果判定的全流程，强调形态学与分子生物学技术的结合，确保检测结果的准确性和可重复性。