NY/T 4682-2025 饲料中血根碱、白屈菜红碱的测定 液相色谱-串联质谱法

中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4682-2025 总结

​​1. 适用范围​​

适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料及植物性饲料原料中血根碱（C20H14NO4）和白屈菜红碱（C21H18NO4）的测定。

• ​​检出限​​：0.002 mg/kg
• ​​定量限​​：0.005 mg/kg

​​2. 方法原理​​

1. ​​提取​​：试样经0.2%盐酸乙腈溶液超声提取，离心合并上清液。
2. ​​净化​​：HLB固相萃取柱净化，滤液经微孔滤膜处理后待测。
3. ​​测定​​：液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分离，电喷雾正离子模式（ESI+）多反应监测（MRM），外标法定量。

​​3. 关键试剂与仪器​​

• ​​试剂​​：甲醇、乙腈（色谱纯）、0.1%甲酸水溶液、0.2%盐酸乙腈溶液、HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）、0.22 μm有机系滤膜。
• ​​标准品​​：血根碱（CAS:2447-54-3）、白屈菜红碱（CAS:34316-15-9），纯度≥98%。
• ​​仪器​​：LC-MS/MS（ESI源）、分析天平（0.1 mg）、超声波清洗机、离心机（≥9000 r/min）。

​​4. 样品制备​​

• 按GB/T 20195制备样品，粉碎过0.425 mm筛，混匀后密封保存。

​​5. 试验步骤​​

1. ​​提取​​：称取2 g试样，加15 mL盐酸乙腈溶液，涡旋超声20分钟，离心后重复提取两次，合并上清液定容至50 mL。
2. ​​净化​​：取3 mL提取液过HLB柱，弃初滤液1 mL，收集续滤液。
3. ​​LC-MS/MS条件​​：
   • ​​色谱柱​​：C18柱（2.1 mm×50 mm, 1.7 μm）。
   • ​​流动相​​：A相（0.1%甲酸水溶液）、B相（乙腈），梯度洗脱（0-10 min内B相由10%升至100%再复位）。
   • ​​质谱参数​​：ESI+模式，监测离子对及碰撞能量见表2，源温度150℃，雾化气800 L/h。

​​6. 定性与定量​​

• ​​定性​​：保留时间偏差≤±2.5%，离子丰度比符合表3允许偏差。
• ​​定量​​：标准曲线法（r≥0.99）或单点校准（浓度偏差≤30%）。
• ​​计算公式​​：
  • 多点校准：w_i = /frac{/rho_i /times V /times f}{m /times 1000}
  • 单点校准：w_i = /frac{A_i /times /rho_{si} /times V /times f}{A_{si} /times m /times 1000}

​​7. 精密度​​

• 重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值≤算术平均值的20%。

​​8. 附录与关键参数​​

• ​​标准溶液色谱图​​：血根碱（332→274）、白屈菜红碱（348→332）的定量离子对见图A.1。
• ​​关键参数表​​：
  • ​​表2​​：监测离子对、锥孔电压及碰撞能量（如血根碱332→274，碰撞能量33 eV）。
  • ​​表3​​：相对离子丰度最大允许偏差（如丰度＞50%时，偏差±20%）。

​​9. 注意事项​​

• 标准溶液需-18℃保存，临用现配。
• 试样溶液浓度超线性范围时需稀释后复测。
• 净化步骤需确保HLB柱活化（文档未明确，建议参照常规操作：甲醇活化、水平衡）。

​​总结特点​​：该方法结合高效提取与LC-MS/MS高灵敏度检测，适用于复杂饲料基质中痕量生物碱的测定，强调严格的定性与定量控制，确保数据准确性。