GB 7300.505-2025 饲料添加剂 第5部分：微生物 凝结芽孢杆菌

　　中华人民共和国国家标准

　　GB7300.505—2025

　　饲料添加剂 第5部分:微生物

　　凝结芽孢杆菌

　　Feedadditives—Part5:LiveMicroorganisms—Bacilluscoagulans

　　2025-06-30发布2026-07-01实施

　　国家市场监督管理总局

　　国家标准化管理委员会发布

　　前 言

　　本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　本 部分为GB7300《饲料添加剂》的第505部分。GB7300已经发布了以下部分:

　　———第1部分:氨基酸、氨基酸盐及其类似物 L-苏氨酸(GB7300.101);

　　———第1部分:氨基酸、氨基酸盐及其类似物 甘氨酸(GB7300.102);

　　———第1部分:氨基酸、氨基酸盐及其类似物 蛋氨酸羟基类似物(GB7300.103);

　　———第1部分:氨基酸、氨基酸盐及其类似物 L-缬氨酸(GB7300.104);

　　———第2部分:维生素及类维生素 L-抗坏血酸-2-磷酸酯盐(GB7300.201);

　　———第2部分:维生素及类维生素 维生素D3油(GB7300.202);

　　———第2部分:维生素及类维生素 甜菜碱(GB7300.203);

　　———第2部分:维生素及类维生素 甜菜碱盐酸盐(GB7300.204);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 碘化钾(GB7300.301);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 亚硒酸钠(GB7300.302);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 碘酸钾(GB7300.303);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 甘氨酸铁络合物(GB7300.304);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 碱式氯化铜(GB7300.305);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 烟酸铬(GB7300.306);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 甘氨酸锌(GB7300.307);

　　———第3部分:矿物元素及其络(螯)合物 苏氨酸锌螯合物(GB7300.308);

　　———第4部分:酶制剂 木聚糖酶(GB7300.401);

　　———第4部分:酶制剂 植酸酶(GB7300.402);

　　———第4部分:酶制剂 纤维素酶(GB7300.403);

　　———第4部分:酶制剂 β-甘露聚糖酶(GB7300.404);

　　———第4部分:酶制剂 α-半乳糖苷酶(GB7300.405);

　　———第5部分:微生物 酿酒酵母(GB7300.501);

　　———第5部分:微生物 植物乳杆菌(GB7300.502);

　　———第5部分:微生物 屎肠球菌(GB7300.503);

　　———第5部分:微生物 嗜酸乳杆菌(GB7300.504);

　　———第5部分:微生物 凝结芽孢杆菌(GB7300.505);

　　———第6部分:非蛋白氮 尿素(GB7300.601);

　　———第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂 碳酸氢钠(GB7300.801);

　　———第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂 丙酸(GB7300.802);

　　———第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂 氯化铵(GB7300.803);

　　———第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂 苯甲酸(GB7300.804);

　　———第9部分:着色剂 β-胡萝卜素粉(GB7300.901);

　　———第9部分:着色剂 β,β-胡萝卜素-4,4-二酮(斑蝥黄)(GB7300.902);

　　Ⅰ

　　GB7300.505—2025

　　———第10部分:调味和诱食物质 谷氨酸钠(GB7300.1001);

　　———第10部分:调味和诱食物质 大蒜素(GB7300.1002);

　　———第10部分:调味和诱食物质 新甲基橙皮苷二氢查耳酮(GB7300.1003);

　　———第13部分:其他 胆汁酸(GB7300.1301)。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出并归口。

　　Ⅱ

　　GB7300.505—2025

　　引 言

　　饲料添加剂是指在饲料加工、制作、使用过程中添加的少量或者微量物质,包括营养性饲料添加剂

　　和一般饲料添加剂。为便于使用,按照产品类型,GB7300《饲料添加剂》分为以下13个部分。

　　———氨基酸、氨基酸盐及其类似物;

　　———维生素及类维生素;

　　———矿物元素及其络(螯)合物;

　　———酶制剂;

　　———微生物;

　　———非蛋白氮;

　　———抗氧化剂;

　　———防腐剂、防霉剂和酸度调节剂;

　　———着色剂;

　　———调味和诱食物质;

　　———粘结剂、抗结块剂、稳定剂和乳化剂;

　　———多糖和寡糖;

　　———其他。

　　本文件的产品凝结芽孢杆菌属于第5大类微生物,因凝结芽孢杆菌是第5个发布的产品标准,所以

　　本文件以GB7300.505编号,作为GB7300的第505部分。

　　Ⅲ

　　GB7300.505—2025

　　饲料添加剂 第5部分:微生物

　　凝结芽孢杆菌

　　1 范围

　　本文件规定了饲料添加剂凝结芽孢杆菌的原料和菌种、技术要求、采样、检验规则及标签、包装、运

　　输、贮存和保质期,描述了相应的试验方法。

　　本文件适用于以凝结芽孢杆菌为菌种,经发酵、添加或不添加载体、干燥等工艺制得的饲料添加剂

　　凝结芽孢杆菌。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文

　　件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于

　　本文件。

　　GB/T5917.1 饲料粉碎粒度测定 两层筛筛分法

　　GB/T6435 饲料中水分的测定

　　GB/T8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定

　　GB10648 饲料标签

　　GB/T13079 饲料中总砷的测定

　　GB/T13080 饲料中铅的测定 原子吸收光谱法

　　GB/T13081 饲料中汞的测定

　　GB/T13082 饲料中镉的测定

　　GB/T13091 饲料中沙门氏菌的测定

　　GB/T13092 饲料中霉菌总数的测定

　　GB/T14699 饲料 采样

　　GB/T18869—2019 饲料中大肠菌群的测定

　　GB/T42959 饲料微生物检验 采样

　　NY/T2071 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定 液相色谱-串联质谱法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　凝结芽孢杆菌 Bacilluscoagulans

　　凝结魏茨曼氏菌 Weizmanniacoagulans

　　凝结海恩德里克斯氏菌 Heyndrickxiacoagulans

　　属于厚壁菌门、芽孢杆菌科、海恩德里克斯氏菌属。

　　注:革兰氏染色阳性,单个细菌呈椭圆或杆状,无鞭毛,产芽孢,芽孢呈椭圆形或球形,位于孢子囊中,中生到次端

　　生,具运动性。

　　1

　　GB7300.505—2025

　　4 原料和菌种

　　4.1 原料

　　来源于《饲料原料目录》和(或)《饲料添加剂品种目录》所列品种。

　　4.2 菌种

　　菌种为凝结芽孢杆菌。

　　5 技术要求

　　5.1 外观与性状

　　色泽均匀一致,无结块,无霉变,无异臭味。

　　注:产品若有特殊发酵气味,视为正常。

　　5.2 凝结芽孢杆菌鉴别

　　应符合附录A 中所述的形态特征、生理生化特征及分子生物学结果。

　　5.3 质量指标

　　应符合表1的要求。

　　表1 质量指标

　　项目指标

　　凝结芽孢杆菌活菌数/(CFU/g) ≥1.0×109

　　水分/% ≤10.0

　　粒度(通过0.85mm 孔径试验筛)/% ≥90.0

　　5.4 卫生指标

　　应符合表2的要求。

　　表2 卫生指标

　　项目指标

　　总砷(以As计)/(mg/kg) ≤2.00

　　铅(Pb)/(mg/kg) ≤5.00

　　汞(Hg)/(mg/kg) ≤0.10

　　镉(Cd)/(mg/kg) ≤0.500

　　黄曲霉毒素B1a/(μg/kg) ≤10.0

　　霉菌总数/(CFU/g) ≤4×104

　　大肠菌群/(MPN/100g) ≤10000

　　沙门氏菌(25g中) 不得检出

　　a 仅适用于添加植物性载体的产品。

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　　GB7300.505—2025

　　6 采样

　　以微生物检验为目的的采样按照GB/T42959执行,以其他指标检验为目的的采样按照GB/T14699

　　执行。

　　7 试验方法

　　7.1 外观与性状

　　取适量试样置于洁净的白色背景中,在自然光线下,观察其色泽、状态,嗅其气味。

　　7.2 凝结芽孢杆菌鉴别

　　按附录A 规定执行。

　　7.3 凝结芽孢杆菌活菌数

　　按附录B规定执行。

　　7.4 水分

　　按GB/T6435规定执行。

　　7.5 粒度

　　按GB/T5917.1规定执行。

　　7.6 总砷

　　按GB/T13079规定执行。

　　7.7 铅

　　按GB/T13080规定执行。

　　7.8 汞

　　按GB/T13081规定执行。

　　7.9 镉

　　按GB/T13082规定执行。

　　7.10 黄曲霉毒素B1

　　按NY/T2071规定执行。

　　7.11 霉菌总数

　　按照GB/T13092规定执行。

　　3

　　GB7300.505—2025

　　7.12 大肠菌群

　　按GB/T18869—2019中乳酸胆盐发酵法规定执行。

　　7.13 沙门氏菌

　　按GB/T13091规定执行。

　　8 检验规则

　　8.1 组批

　　以相同菌株、相同的原料、相同的生产工艺、连续生产或同一班次生产的同一规格的产品为一批,每

　　批产品不应超过50t。

　　8.2 出厂检验

　　出厂检验项目为外观与性状、水分、粒度、凝结芽孢杆菌活菌数。

　　8.3 型式检验

　　型式检验项目为第5章规定的所有项目。在正常生产情况下,每半年至少进行1次型式检验。有

　　下列情况之一,亦应进行型式检验:

　　a) 产品定型投产时;

　　b) 生产工艺或主要原料来源有较大改变,可能影响产品质量时;

　　c) 停产3个月以上,重新恢复生产时;

　　d) 出厂检验结果与上次型式检验结果有较大差异时;

　　e) 行政管理部门提出检验要求时。

　　8.4 判定规则

　　8.4.1 所验项目全部合格,判定为该批次产品合格。

　　8.4.2 检验结果中有任何指标不符合本文件规定时,可自同批产品中重新加倍取样进行复检。若复检

　　有一项结果不符合本文件规定,即判定该批产品不合格。卫生指标中的微生物指标不应复检。

　　8.4.3 除微生物指标外,各项指标的极限数值按GB/T8170中全数值比较法进行判定。

　　9 标签、包装、运输、贮存和保质期

　　9.1 标签

　　按GB10648规定执行。

　　9.2 包装

　　包装材料应无毒、无害、防潮、不透光。

　　9.3 运输

　　运输中防止包装破损、日晒、雨淋,不应与有毒有害物质混运。

　　4

　　GB7300.505—2025

　　9.4 贮存

　　通风、干燥处存放,防晒、防雨淋,不应与有毒有害物质混贮。

　　9.5 保质期

　　未开启包装的产品,在规定的运输、贮存条件下,产品保质期应与标签中标明的保质期一致。

　　10 标准的实施

　　本文件实施之日前生产或进口的产品,可以销售至产品标示的有效期(保质期)限为止。

　　5

　　GB7300.505—2025

　　附 录 A

　　(规范性)

　　凝结芽孢杆菌鉴别

　　A.1 试剂或材料

　　除非另有规定,仅使用分析纯试剂。

　　A.1.1 琼脂糖。

　　A.1.2 DNA 分子质量标准物。

　　A.1.3 革兰氏染色液。

　　A.1.4 生理生化鉴定试剂。

　　A.1.5 细菌基因组提取试剂盒。

　　A.1.6 聚合酶链式反应试剂盒(PCR试剂盒)。

　　A.2 仪器设备

　　A.2.1 PCR仪。

　　A.2.2 电泳仪。

　　A.2.3 凝胶成像分析系统。

　　A.2.4 显微镜:×100倍油镜。

　　A.2.5 离心机。

　　A.2.6 生化培养箱:精度±1℃。

　　A.3 试验步骤

　　A.3.1 菌种纯化

　　改良MRS平板上挑取典型凝结芽孢杆菌单菌落(B.3.2),划线转接培养于改良MRS平板上,

　　45℃±1℃ 培养24h~48h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落,转接保存,备用。

　　A.3.2 形态观察

　　A.3.2.1 菌落形态

　　观察特征菌落(A.3.1),呈白色,凸起,表面光滑,边缘整齐;随着培养时间的延长,菌落颜色变成奶

　　油色。

　　A.3.2.2 菌体形态

　　挑选特征菌落(A.3.1),作革兰氏染色,镜检菌体为紫色、椭圆或杆状。

　　A.3.3 生理生化确证

　　挑选特征菌落(A.3.1)进行生理生化实验,特征应符合表A.1。若表A.1中有1项~2项不符合,应

　　进行分子生物学鉴定。

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　　GB7300.505—2025

　　表A.1 凝结芽孢杆菌生理生化特征

　　生化试验结果生化试验结果

　　厌氧生长+ 接触酶+

　　D-葡萄糖产酸+ 水解酪蛋白-

　　生长NaCl:7% - 利用柠檬酸盐-

　　生长温度:55℃ +

　　注:“+”表示≥90%菌株为阳性;“-”表示≥90%菌株为阴性。

　　A.3.4 分子生物学鉴定

　　A.3.4.1 基因组DNA 提取

　　用细菌基因组提取试剂盒提取凝结芽孢杆菌基因组DNA。

　　A.3.4.2 PCR 扩增与测序

　　A.3.4.2.1 引物合成

　　按照表A.216SrRNA 合成扩增引物。

　　表A.2 16SrRNA 扩增引物序列

　　靶基因名称扩增引物序列测序引物序列

　　16SrRNA 27F:5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

　　1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

　　同扩增引物

　　A.3.4.2.2 PCR 反应

　　PCR扩增体系(25μL)包括:无菌水15μL,10×缓冲液2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)3.5μL,上下

　　游引物(A.3.4.2.1)(10μmol/L)各1.0μL,DNA 聚合酶0.5μL,DNA 模板1.5μL。以无菌水为模板作

　　为阴性对照,以模式菌株的基因组DNA 为模板作为阳性对照。

　　PCR扩增程序:94℃预变性5min;94 ℃变性30s,55 ℃退火30s,72 ℃延伸2min,35个循环;

　　72℃ 终延伸10min。

　　A.3.4.2.3 PCR 扩增产物电泳

　　用电泳缓冲液(0.5×TBE)制备1.0%琼脂糖凝胶,5μLPCR 扩增产物点样,核酸染料染色,DNA

　　分子质量标准物做参照,120V 电泳30min。

　　阴性对照应无条带,阳性对照条带大小应为1500bp左右,当样品检测结果无条带或者条带大小

　　不是1500bp左右,认为扩增失败,当样品检测结果中有清晰明亮的大小为1500bp左右的条带时,认

　　为是目标条带,可以用于测序。

　　A.3.4.2.4 PCR 扩增产物测序

　　电泳结束后,根据DNA 分子质量标准物条带的指示,对目的条带进行胶回收,获得的产物进行

　　7

　　GB7300.505—2025

　　测序。

　　A.3.4.3 测序结果比对

　　将凝结芽孢杆菌的16SrRNA 序列结果(A.3.4.2.4)与DNA 序列数据库基因序列进行比较,与凝

　　结芽孢杆菌模式菌株ATCC7050(基因ID:29814753)的基因序列(表A.3)相似度在99%以上。

　　表A.3 凝结芽孢杆菌ATCC705016SrRNA 参考基因序列

　　菌株16SrRNA基因序列

　　凝结芽孢杆菌

　　ATCC7050

　　1tttactgagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaa

　　61gtcgtgcggaccttttaaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaaca

　　121cgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacgccgggaaaccggggctaataccagata

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　　8

　　GB7300.505—2025

　　附 录 B

　　(规范性)

　　凝结芽孢杆菌活菌数检测方法

　　B.1 试剂或材料

　　除非另有规定,仅使用分析纯试剂。

　　B.1.1 水:GB/T6682,三级。

　　B.1.2 改良MRS培养基:酵母浸粉5.0g、胰蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、葡萄糖5.0g、无水氯化钙

　　0.15g、氯化钠2.5g、一水合硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂粉16.0~20.0g、水

　　1000mL,pH 调至5.0~5.5(25℃),115℃灭菌30min。也可使用相同成分商品化培养基,按使用说

　　明配制。

　　B.1.3 稀释液:称取8.5g氯化钠,1.0g吐温溶于1000mL水中,121℃灭菌30min后备用。

　　B.2 仪器设备

　　B.2.1 天平:精度为0.001g和0.1g。

　　B.2.2 生化培养箱:精度±1℃。

　　B.2.3 恒温振荡器:精度±1℃。

　　B.2.4 涡旋混合器。

　　B.2.5 高压灭菌锅。

　　B.2.6 水浴锅:精度±0.5℃。

　　B.3 试验步骤

　　B.3.1 试样制备

　　称量1g 试样,精确至0.001g,置于250 mL 无菌三角瓶(带玻璃珠),加入99 mL 稀释液

　　(B.1.3),于不超过25℃恒温振荡器200r/min振荡30min,制成1∶100菌悬液。准确移取1∶100菌

　　悬液1.0mL,加入装有9.0mL稀释液(B.1.3)的试管中,涡旋混匀,制成1∶1000稀释菌液。同法制成

　　适宜稀释度的系列稀释菌液。

　　选择上述合适的1个~3个稀释度的稀释菌液,置于80 ℃水浴锅中处理10min,取出冷却至室

　　温,备用。

　　B.3.2 接种和培养

　　准确移取上述稀释菌液(B.3.1)0.1mL,加至已凝固的改良MRS培养基平板中,用无菌涂布棒均匀

　　涂于表面。每个稀释度做两个平行。同时,分别吸取0.1mL稀释液(B.1.3)至两个改良MRS培养基平

　　板中作空白对照。将平板倒置于恒温培养箱中,45℃±1℃培养48h±2h。

　　B.3.3 菌落计数

　　选取特征菌落在30CFU~300CFU 之间的平皿,直接记录菌落总数。若菌落数均不在30CFU~

　　300CFU,调整稀释度后重新测定。

　　9

　　GB7300.505—2025

　　若特征菌落不能确定为凝结芽孢杆菌,按附录A 进行鉴定。

　　B.4 试验数据处理

　　B.4.1 结果计算

　　B.4.1.1 若只有一个稀释级平皿上的菌落数在30CFU~300CFU 内,计算两个平皿菌落数的平均

　　值,再将平均值乘以相应稀释因子,作为每克样品中凝结芽孢杆菌活菌数结果。

　　B.4.1.2 若有两个连续稀释级的平皿菌落数在30CFU~300CFU 内,按式(B.1)计算。

　　N =

　　C1 +C2 (n1 +0.1n2)×d …………………………(B.1)

　　式中:

　　N ———试样中凝结芽孢杆菌活菌数,以CFU/g表示;

　　C1 ———第一稀释级(低稀释倍数)平皿菌落数之和;

　　C2 ———第二稀释级(高稀释倍数)平皿菌落数之和;

　　n1 ———第一稀释级(低稀释倍数)平皿个数;

　　n2 ———第二稀释级(高稀释倍数)平皿个数;

　　d ———稀释度(第一稀释级)。

　　B.4.1.3 若所有稀释级平皿均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

　　B.4.2 结果表示

　　采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法修约,以10的指数表示。

　　根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g表示。

　　参 考 文 献

　　[1] 农业农村部.饲料原料目录

　　[2] 农业农村部.饲料添加剂品种目录