GB 5009.300-2025 食品安全国家标准 食品中左旋肉碱的测定
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资料介绍
中华人民共和国国家标准
GB5009.300—2025
食品安全国家标准
食品中左旋肉碱的测定
2025-03-16发布2025-09-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国家市场监督管理总局发布
前 言
本标准代替GB29989—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》。
本标准与GB29989—2013相比,主要变化如下:
———标准名称更改为《食品安全国家标准 食品中左旋肉碱的测定》;
———更改了分光光度法;
———增加了“第二法 柱前衍生-高效液相色谱法”;
———增加了“第三法 液相色谱-串联质谱法”。
Ⅰ
GB5009.300—2025
食品安全国家标准
食品中左旋肉碱的测定
1 范围
本标准规定了食品中左旋肉碱的测定方法。
第一法分光光度法适用于婴幼儿食品(不含特殊医学用途婴儿配方食品中的乳蛋白部分水解配方、
乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方)和乳品中左旋肉碱的测定。
第二法柱前衍生-高效液相色谱法适用于食品(不含特殊医学用途婴儿配方食品和特殊医学用途配
方食品)中左旋肉碱的测定。
第三法液相色谱-串联质谱法适用于婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品中左旋肉碱的测定。
第一法 分光光度法
2 原理
试样经过水提取,用高氯酸沉淀蛋白质后过滤。滤液中结合态的左旋肉碱经碱皂化游离出来,与乙
酰辅酶A 在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A 和5,5'-二硫
双(2-硝基苯甲酸)反应生成黄色物质,其颜色深浅与游离的辅酶A 含量成正比。因游离的辅酶A 与左
旋肉碱是等摩尔反应关系,可间接求出试样中左旋肉碱的含量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。
3.1 试剂
3.1.1 高氯酸(HClO4)。
3.1.2 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.3 氢氧化钾(KOH)。
3.1.4 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(C14H8N2O8S2)。
3.1.5 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(C8H18N2O4S)。
3.1.6 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2·2H2O)。
3.1.7 乙酰辅酶A(AcetylCoA):纯度≥85%,在2℃~8℃下保存。
3.1.8 乙酰肉碱转移酶(CAT):在2℃~8℃下保存。
3.2 试剂配制
3.2.1 高氯酸溶液(13%):吸取13mL 高氯酸,用水稀释至100mL。
3.2.2 高氯酸溶液(3%):吸取3mL 高氯酸,用水稀释至100mL。
1
GB5009.300—2025
3.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取40g氢氧化钠用水溶解,冷却后稀释至100mL。
3.2.4 氢氧化钾溶液(4mol/L):称取22.4g氢氧化钾用水溶解,冷却后稀释至100mL。
3.2.5 显色储备液:分别称取50mg5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺
酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL水中,用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至7.4~7.6,然后
用水稀释至50mL。4℃保存,有效期3个月。
3.2.6 显色工作液:吸取5mL 显色储备液用水稀释至25mL。
3.2.7 乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液:称取20mg乙酰辅酶A 溶于2mL水中。临用现配。
3.2.8 乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液:吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液,加水至2mL,混匀。临用
现配。
3.3 标准品
左旋肉碱标准品(C7H15NO3,CAS号:541-15-1):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书
的标准物质。使用前于102℃±2℃电热鼓风干燥箱中干燥2h。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 左旋肉碱标准储备液(1mg/mL):准确称取10mg(精确至0.01mg)左旋肉碱置于10mL烧杯
中,加入5mL水溶解,全部转移至10mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色容器
中,4℃避光保存,有效期3个月。
3.4.2 左旋肉碱标准中间液(80μg/mL):吸取左旋肉碱标准储备液2.00mL,置于25mL容量瓶中,用
水定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色容器中,4℃避光保存,有效期1个月。
3.4.3 左旋肉碱系列标准工作液:分别吸取左旋肉碱标准中间液0.125 mL、0.50 mL、1.00 mL、
2.00mL、3.00mL、5.00mL 置于25mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混匀,即得。该系列标准工作液质
量浓度分别为0.4μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、9.6μg/mL、16μg/mL。临用现配。
4 仪器和设备
4.1 分析天平:感量分别为0.001g和0.01mg。
4.2 pH 计。
4.3 恒温水浴装置。
4.4 分光光度计。
4.5 电热鼓风干燥箱。
5 分析步骤
5.1 试样处理
5.1.1 固态试样:准确称取5.0g(精确至0.001g)混合均匀的试样于烧杯中,用30mL40℃温水溶解,
转入100mL容量瓶中。加入10mL高氯酸溶液(13%),混合均匀后静置20min。用水定容至刻度,
混匀,用定量滤纸过滤。
取滤液20mL,用氢氧化钾溶液(4mol/L)调节pH 至12.5~13.0后,置于40℃水浴中60min。冷
却后先用高氯酸溶液(13%)将pH 调至9~10,再用高氯酸溶液(3%)将pH 调节至7.0~7.5。将样液
转入50mL容量瓶中,用水定容。混匀后置于4℃冰箱中静置2h以上。将试样处理液从冰箱中取出
放置至室温,取上清液,用0.45μm 滤膜过滤后备用。
2
GB5009.300—2025
5.1.2 液态试样:准确称取25.0g(精确至0.001g)混合均匀的试样,转入100mL容量瓶中。后续步骤
按5.1.1中“加入10mL高氯酸溶液(13%),混合均匀后静置20min……”处理。
5.2 标准曲线的绘制
吸取左旋肉碱系列标准工作液2.00mL于1cm 比色皿中,加入0.80mL显色工作液和100μL乙
酰辅酶A 溶液,盖上比色皿盖,混合均匀后放入分光光度计中,分光光度计的波长调为412nm,5min
后归零。迅速加入100μL乙酰肉碱转移酶溶液,混合均匀后放入分光光度计中,反应10min后记录吸
光值。以左旋肉碱系列标准工作液的浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,制作标准曲线。
5.3 试样测定
取2.00mL试样处理液按5.2的步骤测定其吸光值。在标准曲线上查得试样待测液的浓度。
6 分析结果的表述
试样中左旋肉碱的含量按式(1)计算。
Χ = c×50 m ×V ×10×100 ……………………(1)
式中:
X ———试样中左旋肉碱的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
c ———由标准曲线得到的试样溶液中左旋肉碱的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
50 ———样液的定容体积,单位为毫升(mL);
m ———试样的取样质量,单位为克(g);
V ———滤液的体积,单位为毫升(mL);
10 ———换算系数;
100 ———样液的定容体积,单位为毫升(mL)。
计算结果保留至小数点后2位。
7 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
8 其他
固态试样的方法检出限为0.6 mg/100g,定量限为2 mg/100g。液态试样的方法检出限为
0.12mg/100g,定量限为0.4mg/100g。
第二法 柱前衍生-高效液相色谱法
9 原理
试样中的左旋肉碱经稀盐酸提取、碱皂化、乙腈沉淀蛋白后,用阳离子交换固相萃取柱净化。净化
液中的左旋肉碱在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下与L-丙酰胺-β-萘胺发生衍生反应,衍生物用高效液相
3
GB5009.300—2025
色谱仪测定,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
10.1 试剂及材料
10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.2 无水乙醇(C2H5OH)。
10.1.3 氨水(NH3·H2O)。
10.1.4 盐酸(HCl)。
10.1.5 氢氧化钾(KOH)。
10.1.6 二氯甲烷(CH2Cl2)。
10.1.7 三乙胺(C6H15N)。
10.1.8 氯甲酸丁酯(C5H9ClO2)。
10.1.9 L-丙酰胺-β-萘胺(C13H14N2O):CAS号为720-82-1。
10.1.10 碳酸氢钠(NaHCO3)。
10.1.11 三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)。
10.1.12 磷酸(H3PO4)。
10.1.13 辛烷磺酸钠(C8H19NaO4S)。
10.1.14 混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX):60mg/3mL或相当者;使用前依次使用3mL甲醇、
3mL水和3mL盐酸溶液(10mmol/L)进行活化。
10.1.15 微孔滤膜:0.45μm,水系。
10.2 试剂配制
10.2.1 盐酸溶液(1mol/L):吸取90mL盐酸,加水稀释至1000mL。
10.2.2 盐酸溶液(0.1mol/L):吸取9mL盐酸,加水稀释至1000mL。
10.2.3 盐酸溶液(10mmol/L):吸取10mL盐酸溶液(0.1mol/L),加水稀释至100mL。
10.2.4 氢氧化钾溶液(1mol/L):称取56g氢氧化钾,用水溶解并稀释至1000mL。
10.2.5 4% 氨水甲醇溶液:吸取4mL氨水,加甲醇稀释至100mL。
10.2.6 衍生溶液:称取0.45gL-丙酰胺-β-萘胺,用无水乙醇溶解并稀释至100mL,于-18℃下保存,
有效期2周。
10.2.7 催化剂Ⅰ:称取0.5g三乙胺,加二氯甲烷稀释至100mL。
10.2.8 催化剂Ⅱ:称取0.5g氯甲酸丁酯,加二氯甲烷稀释至100mL。
10.2.9 碳酸氢钠溶液(50mmol/L):称取0.42g碳酸氢钠,用水溶解并稀释至100mL。
10.2.10 磷酸盐缓冲溶液:称取3.4g三水合磷酸氢二钾和0.43g辛烷磺酸钠,用900mL水溶解,用磷
酸调节pH 至2.5~2
GB5009.300—2025
食品安全国家标准
食品中左旋肉碱的测定
2025-03-16发布2025-09-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国家市场监督管理总局发布
前 言
本标准代替GB29989—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》。
本标准与GB29989—2013相比,主要变化如下:
———标准名称更改为《食品安全国家标准 食品中左旋肉碱的测定》;
———更改了分光光度法;
———增加了“第二法 柱前衍生-高效液相色谱法”;
———增加了“第三法 液相色谱-串联质谱法”。
Ⅰ
GB5009.300—2025
食品安全国家标准
食品中左旋肉碱的测定
1 范围
本标准规定了食品中左旋肉碱的测定方法。
第一法分光光度法适用于婴幼儿食品(不含特殊医学用途婴儿配方食品中的乳蛋白部分水解配方、
乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方)和乳品中左旋肉碱的测定。
第二法柱前衍生-高效液相色谱法适用于食品(不含特殊医学用途婴儿配方食品和特殊医学用途配
方食品)中左旋肉碱的测定。
第三法液相色谱-串联质谱法适用于婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品中左旋肉碱的测定。
第一法 分光光度法
2 原理
试样经过水提取,用高氯酸沉淀蛋白质后过滤。滤液中结合态的左旋肉碱经碱皂化游离出来,与乙
酰辅酶A 在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A 和5,5'-二硫
双(2-硝基苯甲酸)反应生成黄色物质,其颜色深浅与游离的辅酶A 含量成正比。因游离的辅酶A 与左
旋肉碱是等摩尔反应关系,可间接求出试样中左旋肉碱的含量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。
3.1 试剂
3.1.1 高氯酸(HClO4)。
3.1.2 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.3 氢氧化钾(KOH)。
3.1.4 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(C14H8N2O8S2)。
3.1.5 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(C8H18N2O4S)。
3.1.6 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2·2H2O)。
3.1.7 乙酰辅酶A(AcetylCoA):纯度≥85%,在2℃~8℃下保存。
3.1.8 乙酰肉碱转移酶(CAT):在2℃~8℃下保存。
3.2 试剂配制
3.2.1 高氯酸溶液(13%):吸取13mL 高氯酸,用水稀释至100mL。
3.2.2 高氯酸溶液(3%):吸取3mL 高氯酸,用水稀释至100mL。
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3.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取40g氢氧化钠用水溶解,冷却后稀释至100mL。
3.2.4 氢氧化钾溶液(4mol/L):称取22.4g氢氧化钾用水溶解,冷却后稀释至100mL。
3.2.5 显色储备液:分别称取50mg5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺
酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL水中,用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至7.4~7.6,然后
用水稀释至50mL。4℃保存,有效期3个月。
3.2.6 显色工作液:吸取5mL 显色储备液用水稀释至25mL。
3.2.7 乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液:称取20mg乙酰辅酶A 溶于2mL水中。临用现配。
3.2.8 乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液:吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液,加水至2mL,混匀。临用
现配。
3.3 标准品
左旋肉碱标准品(C7H15NO3,CAS号:541-15-1):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书
的标准物质。使用前于102℃±2℃电热鼓风干燥箱中干燥2h。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 左旋肉碱标准储备液(1mg/mL):准确称取10mg(精确至0.01mg)左旋肉碱置于10mL烧杯
中,加入5mL水溶解,全部转移至10mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色容器
中,4℃避光保存,有效期3个月。
3.4.2 左旋肉碱标准中间液(80μg/mL):吸取左旋肉碱标准储备液2.00mL,置于25mL容量瓶中,用
水定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕色容器中,4℃避光保存,有效期1个月。
3.4.3 左旋肉碱系列标准工作液:分别吸取左旋肉碱标准中间液0.125 mL、0.50 mL、1.00 mL、
2.00mL、3.00mL、5.00mL 置于25mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混匀,即得。该系列标准工作液质
量浓度分别为0.4μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、9.6μg/mL、16μg/mL。临用现配。
4 仪器和设备
4.1 分析天平:感量分别为0.001g和0.01mg。
4.2 pH 计。
4.3 恒温水浴装置。
4.4 分光光度计。
4.5 电热鼓风干燥箱。
5 分析步骤
5.1 试样处理
5.1.1 固态试样:准确称取5.0g(精确至0.001g)混合均匀的试样于烧杯中,用30mL40℃温水溶解,
转入100mL容量瓶中。加入10mL高氯酸溶液(13%),混合均匀后静置20min。用水定容至刻度,
混匀,用定量滤纸过滤。
取滤液20mL,用氢氧化钾溶液(4mol/L)调节pH 至12.5~13.0后,置于40℃水浴中60min。冷
却后先用高氯酸溶液(13%)将pH 调至9~10,再用高氯酸溶液(3%)将pH 调节至7.0~7.5。将样液
转入50mL容量瓶中,用水定容。混匀后置于4℃冰箱中静置2h以上。将试样处理液从冰箱中取出
放置至室温,取上清液,用0.45μm 滤膜过滤后备用。
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GB5009.300—2025
5.1.2 液态试样:准确称取25.0g(精确至0.001g)混合均匀的试样,转入100mL容量瓶中。后续步骤
按5.1.1中“加入10mL高氯酸溶液(13%),混合均匀后静置20min……”处理。
5.2 标准曲线的绘制
吸取左旋肉碱系列标准工作液2.00mL于1cm 比色皿中,加入0.80mL显色工作液和100μL乙
酰辅酶A 溶液,盖上比色皿盖,混合均匀后放入分光光度计中,分光光度计的波长调为412nm,5min
后归零。迅速加入100μL乙酰肉碱转移酶溶液,混合均匀后放入分光光度计中,反应10min后记录吸
光值。以左旋肉碱系列标准工作液的浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,制作标准曲线。
5.3 试样测定
取2.00mL试样处理液按5.2的步骤测定其吸光值。在标准曲线上查得试样待测液的浓度。
6 分析结果的表述
试样中左旋肉碱的含量按式(1)计算。
Χ = c×50 m ×V ×10×100 ……………………(1)
式中:
X ———试样中左旋肉碱的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
c ———由标准曲线得到的试样溶液中左旋肉碱的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
50 ———样液的定容体积,单位为毫升(mL);
m ———试样的取样质量,单位为克(g);
V ———滤液的体积,单位为毫升(mL);
10 ———换算系数;
100 ———样液的定容体积,单位为毫升(mL)。
计算结果保留至小数点后2位。
7 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
8 其他
固态试样的方法检出限为0.6 mg/100g,定量限为2 mg/100g。液态试样的方法检出限为
0.12mg/100g,定量限为0.4mg/100g。
第二法 柱前衍生-高效液相色谱法
9 原理
试样中的左旋肉碱经稀盐酸提取、碱皂化、乙腈沉淀蛋白后,用阳离子交换固相萃取柱净化。净化
液中的左旋肉碱在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下与L-丙酰胺-β-萘胺发生衍生反应,衍生物用高效液相
3
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色谱仪测定,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
10.1 试剂及材料
10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.2 无水乙醇(C2H5OH)。
10.1.3 氨水(NH3·H2O)。
10.1.4 盐酸(HCl)。
10.1.5 氢氧化钾(KOH)。
10.1.6 二氯甲烷(CH2Cl2)。
10.1.7 三乙胺(C6H15N)。
10.1.8 氯甲酸丁酯(C5H9ClO2)。
10.1.9 L-丙酰胺-β-萘胺(C13H14N2O):CAS号为720-82-1。
10.1.10 碳酸氢钠(NaHCO3)。
10.1.11 三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)。
10.1.12 磷酸(H3PO4)。
10.1.13 辛烷磺酸钠(C8H19NaO4S)。
10.1.14 混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX):60mg/3mL或相当者;使用前依次使用3mL甲醇、
3mL水和3mL盐酸溶液(10mmol/L)进行活化。
10.1.15 微孔滤膜:0.45μm,水系。
10.2 试剂配制
10.2.1 盐酸溶液(1mol/L):吸取90mL盐酸,加水稀释至1000mL。
10.2.2 盐酸溶液(0.1mol/L):吸取9mL盐酸,加水稀释至1000mL。
10.2.3 盐酸溶液(10mmol/L):吸取10mL盐酸溶液(0.1mol/L),加水稀释至100mL。
10.2.4 氢氧化钾溶液(1mol/L):称取56g氢氧化钾,用水溶解并稀释至1000mL。
10.2.5 4% 氨水甲醇溶液:吸取4mL氨水,加甲醇稀释至100mL。
10.2.6 衍生溶液:称取0.45gL-丙酰胺-β-萘胺,用无水乙醇溶解并稀释至100mL,于-18℃下保存,
有效期2周。
10.2.7 催化剂Ⅰ:称取0.5g三乙胺,加二氯甲烷稀释至100mL。
10.2.8 催化剂Ⅱ:称取0.5g氯甲酸丁酯,加二氯甲烷稀释至100mL。
10.2.9 碳酸氢钠溶液(50mmol/L):称取0.42g碳酸氢钠,用水溶解并稀释至100mL。
10.2.10 磷酸盐缓冲溶液:称取3.4g三水合磷酸氢二钾和0.43g辛烷磺酸钠,用900mL水溶解,用磷
酸调节pH 至2.5~2