T/GDFS 47-2024 湿地松种质资源离体超低温保存技术规范
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资料介绍
ICS 65.020.01
CCS B 05
广东省林学会团体标准
T/GDFS 47—2024
湿地松种质资源离体超低温保存技术规范
Code of practice for in vitro cryopreservation of germplasm resources of Pinus elliottii
2024 - 11 - 06发布2024 - 11 - 06实施
广东省林学会 发布
目次
前言 ................................................................................. II
1 范围 ............................................................................... 1
2 规范性引用文件 ..................................................................... 1
3 术语和定义 ......................................................................... 1
4 仪器设备 ........................................................................... 1
5 基本程序 ........................................................................... 2
6 材料准备 ........................................................................... 2
7 超低温保存 ......................................................................... 3
8 提取 ............................................................................... 4
9 建档 ............................................................................... 5
附录A（资料性） 采收母株编号表（含示例数据） ......................................... 6
附录B（资料性） 超低温保存信息表（含示例数据） ....................................... 7
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II
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由广东省林学会团体标准化技术委员会提出并归口。
本文件起草单位：广东省林业科学研究院。
本文件主要起草人：刘阳、王为民、王哲、曾明、郭文冰、龙永彬、赵奋成、吴惠姗、伍彩云、欧阳曦。
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1
湿地松种质资源离体超低温保存技术规范
1 范围
本文件规定了湿地松（Pinus elliottii Engelm.）种质资源离体超低温保存的仪器设备、基本程序、材料准备、超低温保存、提取、建档等技术要求。
本文件适用于湿地松种质资源的离体超低温保存。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 5458 液氮生物容器
GB 8599 大型蒸汽灭菌器技术要求 自动控制型
GB/T 14174 大口径液氮容器
GB 21551.4 家用和类似用途电器的抗菌、除菌、净化功能电冰箱的特殊要求
GJB 2253A 氮气和液氮安全应用准则
JG/T 292 洁净工作台
YY 646 小型蒸汽灭菌器 自动控制型
YY 1007 立式蒸汽灭菌器
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。 湿地松 Pinus elliottii Engelm.
松科松属高大乔木，原产美国东南部暖带潮湿的低海拔地区，已广泛引种至我国栽培，在60多年的育种选择和驯化过程中逐渐乡土化。适生于低山丘陵地带，耐水湿，树干通直，生长势好，为我国长江以南地区极有发展前途的造林树种。 超低温保存 cryopreservation
在液氮液相（-196 ℃）或液氮雾相（-150 ℃）中对离体的植物组织或细胞材料进行长期保存，在适宜条件下解冻可恢复生活力，并保持原来遗传特性。 冷冻保护剂cryoprotectant
可以保护生物器官、组织或细胞等材料免受冷冻损伤的物质，本文件中涉及的冷冻保护剂有二甲基亚砜、山梨醇等1种或多种物质的组合。
4 仪器设备 洁净工作台
可提供无尘洁净、无菌工作环境等级为100级（ISO等级5）的局部操作环境的箱式空气净化设备，技术指标应符合JG/T 292的要求。 高压蒸汽灭菌器
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2
对器械、辅料、玻璃器皿、溶液、培养基进行消毒灭菌的装置，根据其容积大小或使用方式的不同，技术指标应符合GB 8599、YY 646、YY 1007的要求。 冰箱
可用普通-20 ℃冰箱及-80 ℃冰箱，技术指标应符合GB 21551.4的要求。 程序降温仪
按照规定程序要求进行降温冷冻，用于冷冻生物样品、细胞、组织或其他敏感材料。 液氮罐
分储运型和运输型两类，技术指标应符合GB/T 5458的要求。
5 基本程序
湿地松种质资源离体超低温保存应遵循的操作流程见图1。
图
1 湿地松种质资源离体超低温保存技术流程图
6 材料准备 培养基
诱导培养基为：DCR + 麦芽糖15 g·L-1 + NAA 2 mg·L-1 + 6-BA 0.63 mg·L-1 + KT 0.61 mg·L-1 + 植物凝胶3 g·L-1，pH值为5.8 ± 0.2；增殖培养基为：DCR + 蔗糖20 g·L-1 + 2,4-D 2 mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 + 植物凝胶3 g·L-1，pH值为5.8 ± 0.2；增殖液体培养基为增殖培养基不添加植物凝胶；半固体培养基为增殖培养基中植物凝胶用量调整为1.8 g·L-1。 胚性愈伤组织的诱导
于6月～7月采收湿地松未成熟球果，记录采收球果母株的相关信息并编号（参见附录A）；种子消毒后，剥取种仁为外植体，置于诱导培养基上培养，待诱导出胚性愈伤组织后，转移至增殖培养基上继续培养。 胚性无性系的建立
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3
将每个外植体诱导产生的胚性愈伤组织分开培养，形成白色或淡黄色、松软有粘性、增殖迅速的胚性愈伤团，待胚性愈伤团稳定增殖至大于500 mg时，建立胚性无性系并编号。 胚性无性系的增殖扩繁
已建立的胚性无性系可通过固体培养、液体培养或生物反应器培养等方式进行增殖扩繁，其中冷冻材料的扩繁以固体培养为优，具体操作为：选取已培养13±1 d的胚性愈伤团新鲜生长的部分，置于新的固体增殖培养基上。
7 超低温保存 冷冻前处理
7.1.1 预培养
取固体增殖培养10±1 d的胚性愈伤团新鲜生长的部分，按每1 g胚性愈伤团加入4 mL预培养液的比例加入预培养液，置于摇床上进行液体悬浮培养，100 r/min，23±1 ℃，暗培养，40 h～48 h，获得预培养混合物，优选的预培养液为液体增殖培养基附加0.4 M的山梨醇。
7.1.2 预处理
在预培养混合物中分次缓慢滴加冷冻保护剂，充分混合后，置于冰上预处理1.5 h，每10 min摇晃液体一次，使其充分混合，优选的冷冻保护剂为7.5%的二甲基亚砜。 冷冻
7.2.1 降温
按以下步骤操作：
a)
将经7.1处理后包含胚性细胞团、预培养液和冷冻保护液的混合物分装入容积不大于2 mL冻存小管内，装入混合物的体积不超过冻存小管容积的1/2，根据无性系编号，在小管上做好标记；
b)
将冻存小管装盒后置于程序降温仪内，设定降温程序为-0.33 ℃/min，起始温度为0 ℃，目标温度为-40 ℃，且在目标温度保持30 min以上。
7.2.2 超低温处理
将经过程序降温后的盒装冷冻小管装入液氮罐贮藏专用格件中，放入盛有液态氮（-196 ℃）的大口径液氮罐中，液氮罐应符合GB/T 14174的要求，液氮的使用应符合GJB 2253A的要求。
7.2.3 保存
7.2.3.1 数量
每个胚性无性系应保存不同继代次数的胚性细胞团至少2批次，每批次不少于10个冻存小管，通过初始生活力检测后，该批次冻存小管入库登记并长期保存。
7.2.3.2 要求
按以下要求执行：
a)
用于长期保存的液氮罐，应尽可能减少取放材料的次数，取放材料液氮挥发后应及时补充；
b)
应安排专人管理液氮罐及存放室，存放室保持通风，定期检查液氮罐并保持液氮罐内的液氮充足；
c)
将冷冻材料从1个液氮罐转移到另外1个液氮罐时应有2个人配合操作，转移工作应1 min内完成；
d)
操作液氮罐时应做好防护，佩戴护目镜，御寒手套并穿着高帮鞋；
e)
液氮的使用和操作应符合GJB 2253A的要求。 复苏及利用
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4
7.3.1 解冻
迅速取出冻存小管置于液氮中，待管内液氮挥发后，用37 ℃～40 ℃无菌温水均匀浸泡冻存小管，至管内的冰块刚融化时，将冻存小管置于冰上。
7.3.2 复水
将刚解冻的液体倒在无菌滤纸上，10 kPa，3 s～5 s简短抽滤，然后置于半固体增殖培养基上复水1 h，再将胚性愈伤团同滤纸一起转移至新的半固体增殖培养基上，复水1 d。
7.3.3 恢复培养
将复水后的胚性愈伤团连同滤纸一起置于固体增殖培养基上进行恢复培养，连续培养12 d～14 d后继代1次，继代2次后可见胚性愈伤团恢复生长。
7.3.4 成熟培养
将恢复生长的胚性愈伤团按上述6.4的方法进行扩繁后，转移至成熟培养基上进行成熟培养；将成熟培养后获得的体细胞胚移入萌发培养基中进行萌发培养，待根芽萌出后，继续培养至苗高2 cm以上，根长1 cm以上时，进行炼苗及移栽。 生活力检测
7.4.1 检测方法
7.4.1.1 染色法
取冻存材料，按7.3.1、7.3.2解冻并复水后，按以下步骤操作：
a)
称取0.1 g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），溶于100 mL的0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）中，配制成0.1%TTC染色液；
b)
取0.25 g复水后的胚性愈伤团，用5 mL的0.1%TTC染色液浸泡，避光染色24 h（25±1 ℃）；
c)
吸去染色液并用蒸馏水清洗2次～3次，加入5 mL的95%酒精，60 ℃恒温水浴30 min；
d)
冷却后，吸取等体积上清液，在485 nm下测定吸光度值；
e)
以相应的0.25 g新鲜胚性愈伤团为对照，确保与冷冻并复水后的胚性愈伤团同时同样地进行以上步骤，用相对存活率表示冻存材料的生活力；
f)
相对存活率=冻存后材料的吸光度值/新鲜材料的吸光度值×100%。
7.4.1.2 培养法
取冻存材料，按7.3.1、7.3.2、7.3.3的步骤操作，记录已恢复培养的板数，计算恢复生长的板数比例。
7.4.2 初始检测
按以下步骤操作：
a)
液氮超低温处理后的3 d～7 d内，每个无性系应复苏1个～3个冷冻小管中的冷冻保存材料，并检测其初始细胞活力，检测方法同7.4.1；
b)
染色法检测初始生活力高于60%，或培养法能够获得复苏后正常生长的胚性愈伤团，该无性系可进行超低温长期保存，否则需重新选择胚性愈伤团进行以上7.1及7.2步骤处理。
7.4.3 抽检
按以下步骤执行：
a)
种质资源入库3年后，每年应进行1次生活力抽检，抽检方法同7.4.1；
b)
如抽检结果显示冻存材料已失去细胞活力，应及时登记清理。
8 提取
应事先提交申请，在数据库中核对无误并登记后，由专人进行提取操作，提取方法同7.3。
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5
9 建档 登记
按以下要求进行登记：
a)
每1份入库种质应登记未成熟球果的采收地点、采种母株的行列号、采种母株的资源代号、母株原产地及来源信息；
b)
按入库的先后顺序，对采种母株进行编号，形成采种母株编号表（参见附录A）；
c)
来自同一采收母株的胚性无性系，按建系的先后顺序进行编号；
d)
建系后应及时归档，每个胚性无性系的代号不得重复；
e)
在冷冻小管及冷冻盒书写标签时，要使用清晰、无法擦除的油性笔书写；有条件的机构可采用激光打印标签或数字化标签，以减少错误的发生。 存储与备份
按以下要求进行存储和备份：
a)
建立数据库存储种质资源的基本信息和超低温保存的相关信息；
b)
超低温保存的相关信息应包括贮藏日期、贮藏罐编号、贮藏罐拉架号、冷冻盒代号、已冷冻小管数量、初始活力检测结果、监测结果、冷冻小管取出日期、数量及用途，形成超低温保存信息表（参见附录B）；
c)
定期对计算机中保存的数据库进行备份，至少应有2份数据库拷贝存储在不同的地方。 更新
按以下要求进行更新：
a)
每次需要从超低温保存库中提取种质，都应按8的程序进行申请，并在数据库中登记冷冻小管取出日期、数量及用途；
b)
冻存材料的生活力检测结果应及时更新至数据库内。
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6
附录A （资料性） 采种母株编号表（含示例数据）
表A.1给出了采种母株编号表及其示例数据。
表A.1 采种母株编号表（含示例数据）
编号
采收地点
种子园名称
母株行列号
母株代号
母株来源
父本来源
胚性无性系建立时间
胚性无性系编号
1
广东省台山市
湿地松精选种子园
1-12
A05-3
建园优良无性系，原产地美国佐治亚州
种子园自由授粉
2019年10月
1-1至1-22
2
广东省台山市
湿地松精选种子园
11-13
A04-1
建园优良无性系，原产地美国佐治亚州
种子园自由授粉
2019年10月
2-1至2-13
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7
附录B （资料性） 超低温保存信息表（含示例数据）
表B.1给出了超低温保存信息表及其示例数据。
表B.1 超低温保存信息表（含示例数据）
无性系编号
贮藏日期
贮藏罐编号
贮藏罐拉架号
冷冻盒代号
冷冻小管总数
初始活力检测结果（%）
抽样监测结果（%）
小管取出日期
数量
用途
1-1
2020/01/06
1
1
1~2
24
73.83
53.73
2021/03/07
1
抽检
1-6
2020/01/06
1
1
3~4
24
84.27
2-3
2020/03/01
1
2
1~2
24
77.12
2-5
2020/03/01
1
2
3~4
24
64.45
CCS B 05
广东省林学会团体标准
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Code of practice for in vitro cryopreservation of germplasm resources of Pinus elliottii
2024 - 11 - 06发布2024 - 11 - 06实施
广东省林学会 发布
目次
前言 ................................................................................. II
1 范围 ............................................................................... 1
2 规范性引用文件 ..................................................................... 1
3 术语和定义 ......................................................................... 1
4 仪器设备 ........................................................................... 1
5 基本程序 ........................................................................... 2
6 材料准备 ........................................................................... 2
7 超低温保存 ......................................................................... 3
8 提取 ............................................................................... 4
9 建档 ............................................................................... 5
附录A（资料性） 采收母株编号表（含示例数据） ......................................... 6
附录B（资料性） 超低温保存信息表（含示例数据） ....................................... 7
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II
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由广东省林学会团体标准化技术委员会提出并归口。
本文件起草单位：广东省林业科学研究院。
本文件主要起草人：刘阳、王为民、王哲、曾明、郭文冰、龙永彬、赵奋成、吴惠姗、伍彩云、欧阳曦。
T/GDFS 47—2024
1
湿地松种质资源离体超低温保存技术规范
1 范围
本文件规定了湿地松（Pinus elliottii Engelm.）种质资源离体超低温保存的仪器设备、基本程序、材料准备、超低温保存、提取、建档等技术要求。
本文件适用于湿地松种质资源的离体超低温保存。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 5458 液氮生物容器
GB 8599 大型蒸汽灭菌器技术要求 自动控制型
GB/T 14174 大口径液氮容器
GB 21551.4 家用和类似用途电器的抗菌、除菌、净化功能电冰箱的特殊要求
GJB 2253A 氮气和液氮安全应用准则
JG/T 292 洁净工作台
YY 646 小型蒸汽灭菌器 自动控制型
YY 1007 立式蒸汽灭菌器
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。 湿地松 Pinus elliottii Engelm.
松科松属高大乔木，原产美国东南部暖带潮湿的低海拔地区，已广泛引种至我国栽培，在60多年的育种选择和驯化过程中逐渐乡土化。适生于低山丘陵地带，耐水湿，树干通直，生长势好，为我国长江以南地区极有发展前途的造林树种。 超低温保存 cryopreservation
在液氮液相（-196 ℃）或液氮雾相（-150 ℃）中对离体的植物组织或细胞材料进行长期保存，在适宜条件下解冻可恢复生活力，并保持原来遗传特性。 冷冻保护剂cryoprotectant
可以保护生物器官、组织或细胞等材料免受冷冻损伤的物质，本文件中涉及的冷冻保护剂有二甲基亚砜、山梨醇等1种或多种物质的组合。
4 仪器设备 洁净工作台
可提供无尘洁净、无菌工作环境等级为100级（ISO等级5）的局部操作环境的箱式空气净化设备，技术指标应符合JG/T 292的要求。 高压蒸汽灭菌器
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对器械、辅料、玻璃器皿、溶液、培养基进行消毒灭菌的装置，根据其容积大小或使用方式的不同，技术指标应符合GB 8599、YY 646、YY 1007的要求。 冰箱
可用普通-20 ℃冰箱及-80 ℃冰箱，技术指标应符合GB 21551.4的要求。 程序降温仪
按照规定程序要求进行降温冷冻，用于冷冻生物样品、细胞、组织或其他敏感材料。 液氮罐
分储运型和运输型两类，技术指标应符合GB/T 5458的要求。
5 基本程序
湿地松种质资源离体超低温保存应遵循的操作流程见图1。
图
1 湿地松种质资源离体超低温保存技术流程图
6 材料准备 培养基
诱导培养基为：DCR + 麦芽糖15 g·L-1 + NAA 2 mg·L-1 + 6-BA 0.63 mg·L-1 + KT 0.61 mg·L-1 + 植物凝胶3 g·L-1，pH值为5.8 ± 0.2；增殖培养基为：DCR + 蔗糖20 g·L-1 + 2,4-D 2 mg·L-1 + 6-BA 0.5 mg·L-1 + 植物凝胶3 g·L-1，pH值为5.8 ± 0.2；增殖液体培养基为增殖培养基不添加植物凝胶；半固体培养基为增殖培养基中植物凝胶用量调整为1.8 g·L-1。 胚性愈伤组织的诱导
于6月～7月采收湿地松未成熟球果，记录采收球果母株的相关信息并编号（参见附录A）；种子消毒后，剥取种仁为外植体，置于诱导培养基上培养，待诱导出胚性愈伤组织后，转移至增殖培养基上继续培养。 胚性无性系的建立
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3
将每个外植体诱导产生的胚性愈伤组织分开培养，形成白色或淡黄色、松软有粘性、增殖迅速的胚性愈伤团，待胚性愈伤团稳定增殖至大于500 mg时，建立胚性无性系并编号。 胚性无性系的增殖扩繁
已建立的胚性无性系可通过固体培养、液体培养或生物反应器培养等方式进行增殖扩繁，其中冷冻材料的扩繁以固体培养为优，具体操作为：选取已培养13±1 d的胚性愈伤团新鲜生长的部分，置于新的固体增殖培养基上。
7 超低温保存 冷冻前处理
7.1.1 预培养
取固体增殖培养10±1 d的胚性愈伤团新鲜生长的部分，按每1 g胚性愈伤团加入4 mL预培养液的比例加入预培养液，置于摇床上进行液体悬浮培养，100 r/min，23±1 ℃，暗培养，40 h～48 h，获得预培养混合物，优选的预培养液为液体增殖培养基附加0.4 M的山梨醇。
7.1.2 预处理
在预培养混合物中分次缓慢滴加冷冻保护剂，充分混合后，置于冰上预处理1.5 h，每10 min摇晃液体一次，使其充分混合，优选的冷冻保护剂为7.5%的二甲基亚砜。 冷冻
7.2.1 降温
按以下步骤操作：
a)
将经7.1处理后包含胚性细胞团、预培养液和冷冻保护液的混合物分装入容积不大于2 mL冻存小管内，装入混合物的体积不超过冻存小管容积的1/2，根据无性系编号，在小管上做好标记；
b)
将冻存小管装盒后置于程序降温仪内，设定降温程序为-0.33 ℃/min，起始温度为0 ℃，目标温度为-40 ℃，且在目标温度保持30 min以上。
7.2.2 超低温处理
将经过程序降温后的盒装冷冻小管装入液氮罐贮藏专用格件中，放入盛有液态氮（-196 ℃）的大口径液氮罐中，液氮罐应符合GB/T 14174的要求，液氮的使用应符合GJB 2253A的要求。
7.2.3 保存
7.2.3.1 数量
每个胚性无性系应保存不同继代次数的胚性细胞团至少2批次，每批次不少于10个冻存小管，通过初始生活力检测后，该批次冻存小管入库登记并长期保存。
7.2.3.2 要求
按以下要求执行：
a)
用于长期保存的液氮罐，应尽可能减少取放材料的次数，取放材料液氮挥发后应及时补充；
b)
应安排专人管理液氮罐及存放室，存放室保持通风，定期检查液氮罐并保持液氮罐内的液氮充足；
c)
将冷冻材料从1个液氮罐转移到另外1个液氮罐时应有2个人配合操作，转移工作应1 min内完成；
d)
操作液氮罐时应做好防护，佩戴护目镜，御寒手套并穿着高帮鞋；
e)
液氮的使用和操作应符合GJB 2253A的要求。 复苏及利用
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7.3.1 解冻
迅速取出冻存小管置于液氮中，待管内液氮挥发后，用37 ℃～40 ℃无菌温水均匀浸泡冻存小管，至管内的冰块刚融化时，将冻存小管置于冰上。
7.3.2 复水
将刚解冻的液体倒在无菌滤纸上，10 kPa，3 s～5 s简短抽滤，然后置于半固体增殖培养基上复水1 h，再将胚性愈伤团同滤纸一起转移至新的半固体增殖培养基上，复水1 d。
7.3.3 恢复培养
将复水后的胚性愈伤团连同滤纸一起置于固体增殖培养基上进行恢复培养，连续培养12 d～14 d后继代1次，继代2次后可见胚性愈伤团恢复生长。
7.3.4 成熟培养
将恢复生长的胚性愈伤团按上述6.4的方法进行扩繁后，转移至成熟培养基上进行成熟培养；将成熟培养后获得的体细胞胚移入萌发培养基中进行萌发培养，待根芽萌出后，继续培养至苗高2 cm以上，根长1 cm以上时，进行炼苗及移栽。 生活力检测
7.4.1 检测方法
7.4.1.1 染色法
取冻存材料，按7.3.1、7.3.2解冻并复水后，按以下步骤操作：
a)
称取0.1 g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），溶于100 mL的0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）中，配制成0.1%TTC染色液；
b)
取0.25 g复水后的胚性愈伤团，用5 mL的0.1%TTC染色液浸泡，避光染色24 h（25±1 ℃）；
c)
吸去染色液并用蒸馏水清洗2次～3次，加入5 mL的95%酒精，60 ℃恒温水浴30 min；
d)
冷却后，吸取等体积上清液，在485 nm下测定吸光度值；
e)
以相应的0.25 g新鲜胚性愈伤团为对照，确保与冷冻并复水后的胚性愈伤团同时同样地进行以上步骤，用相对存活率表示冻存材料的生活力；
f)
相对存活率=冻存后材料的吸光度值/新鲜材料的吸光度值×100%。
7.4.1.2 培养法
取冻存材料，按7.3.1、7.3.2、7.3.3的步骤操作，记录已恢复培养的板数，计算恢复生长的板数比例。
7.4.2 初始检测
按以下步骤操作：
a)
液氮超低温处理后的3 d～7 d内，每个无性系应复苏1个～3个冷冻小管中的冷冻保存材料，并检测其初始细胞活力，检测方法同7.4.1；
b)
染色法检测初始生活力高于60%，或培养法能够获得复苏后正常生长的胚性愈伤团，该无性系可进行超低温长期保存，否则需重新选择胚性愈伤团进行以上7.1及7.2步骤处理。
7.4.3 抽检
按以下步骤执行：
a)
种质资源入库3年后，每年应进行1次生活力抽检，抽检方法同7.4.1；
b)
如抽检结果显示冻存材料已失去细胞活力，应及时登记清理。
8 提取
应事先提交申请，在数据库中核对无误并登记后，由专人进行提取操作，提取方法同7.3。
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9 建档 登记
按以下要求进行登记：
a)
每1份入库种质应登记未成熟球果的采收地点、采种母株的行列号、采种母株的资源代号、母株原产地及来源信息；
b)
按入库的先后顺序，对采种母株进行编号，形成采种母株编号表（参见附录A）；
c)
来自同一采收母株的胚性无性系，按建系的先后顺序进行编号；
d)
建系后应及时归档，每个胚性无性系的代号不得重复；
e)
在冷冻小管及冷冻盒书写标签时，要使用清晰、无法擦除的油性笔书写；有条件的机构可采用激光打印标签或数字化标签，以减少错误的发生。 存储与备份
按以下要求进行存储和备份：
a)
建立数据库存储种质资源的基本信息和超低温保存的相关信息；
b)
超低温保存的相关信息应包括贮藏日期、贮藏罐编号、贮藏罐拉架号、冷冻盒代号、已冷冻小管数量、初始活力检测结果、监测结果、冷冻小管取出日期、数量及用途，形成超低温保存信息表（参见附录B）；
c)
定期对计算机中保存的数据库进行备份，至少应有2份数据库拷贝存储在不同的地方。 更新
按以下要求进行更新：
a)
每次需要从超低温保存库中提取种质，都应按8的程序进行申请，并在数据库中登记冷冻小管取出日期、数量及用途；
b)
冻存材料的生活力检测结果应及时更新至数据库内。
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附录A （资料性） 采种母株编号表（含示例数据）
表A.1给出了采种母株编号表及其示例数据。
表A.1 采种母株编号表（含示例数据）
编号
采收地点
种子园名称
母株行列号
母株代号
母株来源
父本来源
胚性无性系建立时间
胚性无性系编号
1
广东省台山市
湿地松精选种子园
1-12
A05-3
建园优良无性系，原产地美国佐治亚州
种子园自由授粉
2019年10月
1-1至1-22
2
广东省台山市
湿地松精选种子园
11-13
A04-1
建园优良无性系，原产地美国佐治亚州
种子园自由授粉
2019年10月
2-1至2-13
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7
附录B （资料性） 超低温保存信息表（含示例数据）
表B.1给出了超低温保存信息表及其示例数据。
表B.1 超低温保存信息表（含示例数据）
无性系编号
贮藏日期
贮藏罐编号
贮藏罐拉架号
冷冻盒代号
冷冻小管总数
初始活力检测结果（%）
抽样监测结果（%）
小管取出日期
数量
用途
1-1
2020/01/06
1
1
1~2
24
73.83
53.73
2021/03/07
1
抽检
1-6
2020/01/06
1
1
3~4
24
84.27
2-3
2020/03/01
1
2
1~2
24
77.12
2-5
2020/03/01
1
2
3~4
24
64.45