T/CHATA 037-2024 基于固体培养基的结核分枝杆菌比例法 药物敏感性试验操作规范
- 文件大小：490.39 KB
- 标准类型：医药卫生
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-02-22
- 下载次数：
- 标签：
资料介绍
团体标准
ICS 11.020
CCS C 05
T/CHATA 037—2024 基于固体培养基的结核分枝杆菌比例法药物敏感性试验操作规范
The guideline on operation of solid medium-based proportionmethod for drug sensitivity testing of mycobacterium tuberculosis
2024-06-11 发布2024-06-11 实施
中国防痨协会发布
目次
前言............................................................................ III
1 范围............................................................................. 1
2 规范性引用文件................................................................... 1
3 术语和定义....................................................................... 1
4 对象与样本........................................................................2
5 设施与设备....................................................................... 2
6 试剂与耗材....................................................................... 2
7 培养基、药物纯品、药物溶液保存................................................... 2
7.1 培养基保存................................................................. 2
7.2 药物纯品保存............................................................... 2
7.3 药物溶液保存............................................................... 3
8 受试菌选择....................................................................... 3
8.1 总体原则................................................................... 3
8.2 直接应用初代分离菌株....................................................... 3
8.3 需要二次传代培养的菌株..................................................... 3
9 菌悬液制备与菌液稀释............................................................. 4
9.1 菌悬液制备................................................................. 4
9.2 菌液稀释................................................................... 4
10 接种与培养...................................................................... 5
10.1 接种...................................................................... 5
10.2 培养...................................................................... 5
11 结果记录、判读与报告............................................................ 5
11.1 结果记录.................................................................. 5
11.2 结果判读.................................................................. 5
11.3 结果报告.................................................................. 6
12 质量控制........................................................................ 6
T/CHATA 037—2024
II
12.1 人员培训和技能考核...........................................................6
12.2 仪器设备的质量控制...........................................................6
12.3 DST 前质量控制...............................................................6
12.4 DST 中质量控制...............................................................7
12.5 DST 后质量控制...............................................................7
12.6 质控参考菌株的使用..........................................................7
13 实验室生物安全................................................................... 7
附录A (规范性) 结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程图.......................... 8
附录B (资料性) L-J 对照培养基和含药培养基制备...................................... 9
附录C (资料性) 7H10/7H11 对照培养基和含药培养基制备.............................. 111
附录D (资料性) 结核分枝杆菌体外药物敏感性试验测试药物溶液配制.................... 133
附录E (资料性) ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株........................................ 155
参考文献............................................................................16
T/CHATA 037—2024
III
前言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由广州市胸科医院、中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心、首都医科大学附属北
京胸科医院共同提出。
本文件由中国防痨协会归口。
本文件起草单位：广州市胸科医院、中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心、首都医科大
学附属北京胸科医院、同济大学附属上海市肺科医院、中国人民解放军总医院第八医学中心、重庆
市公共卫生医疗救治中心、天津市海河医院、山东省公共卫生临床中心。
本文件主要起草人：刘志辉、欧喜超、黄海荣、余方友、吴雪琼、王静、孙海柏、邓云峰、刘
健雄、胡锦兴、夏辉、姜广路、于霞、宛宝山、梁艳、张丽霞、王俊玲、蔡杏珊、胡族琼、王琪、
孟繁荣、关平、刘欣、牛群、苏碧仪、罗春明、曹智忠。
T/CHATA 037—2024
1
基于固体培养基的结核分枝杆菌比例法
药物敏感性试验操作规范
1 范围
本文件规定了应用固体培养基进行结核分枝杆菌比例法药物敏感试验的技术要求和操作规范。
本文件适用于我国各级疾病预防控制机构、结核病定点医疗机构、基层医疗卫生机构、综合医
疗机构和其他相关机构参照国家生物安全执行的医学实验室开展的结核分枝杆菌分离株对常用抗结
核药物敏感性的体外定性检测工作。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用
文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
适用于本文件。
WS 233-2017 病原微生物实验室生物安全通用准则
WS/T 442-2014 临床实验室生物安全指南
T/CECS 662-2020 医学生物安全二级实验室建筑技术标准
中华人民共和国生物安全法（2024年修正）
可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定(卫生部令[2005]45号)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
药物敏感性试验drug sensitivity testing ；DST
检测微生物（本文件特指结核分枝杆菌）对抗微生物药物（本文件特指抗结核药物）的体外敏
感性试验，以指导临床合理用药。
3.2
最小抑菌浓度minimal inhibitory concentration；MIC
体外药物敏感性测试中能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度，用于定量测定体外抗菌活性。
3.3
T/CHATA 037—2024
2
临界浓度critical concentration；CC
抗结核药物在体外能够抑制99%野生型结核分枝杆菌生长的最低浓度。
3.4
临床折点clinical breakpoint；CB
基于临床结果数据、MIC分布、遗传标记物和包括药物剂量在内的药动学-药效学数据的相关性
决定的、用于区分对治疗可能有无反应的高于临界浓度的MIC。
注：临床折点用于指导患者治疗中的个人临床决策，但不适用于耐药性监测目的。
4 对象与样本
检测对象主要包括诊断或治疗过程中病原学阳性的结核病患者，检测样本为液体培养或固体培
养阳性并鉴定为结核分枝杆菌的初次分离纯培养物或者次代转种纯培养物，具体检测流程按附录A。
5 设施与设备
按T/CECS 662—2020建设生物安全Ⅱ级实验室，实验室应配备有Ⅱ级生物安全柜和高压蒸汽灭
菌器等生物安全设备，同时配备恒温培养箱、涡旋振荡器、普通冰箱(2℃～8 ℃)、微量可调移液器
(10μL、100μL、1000 μL)、比浊仪或细菌超声分散计数仪等。
6 试剂与耗材
宜使用自制或商品化的改良中性罗氏（L-J）培养基，也可根据试验需求选择琼脂培养基（如
Middle brook 7H10、Middle brook 7H11）等，但应注意：药物应为具有效价、纯度标识的药物标
准粉或纯粉，不同培养基其含药浓度可能不同（见附录B和附录C）。
耗材主要包括22 SWG标准接种环、涂布棒、微量带滤芯吸嘴(10μL、100μL、1000μL)、灭菌
磨菌瓶（带有玻璃珠的无菌螺旋盖小瓶）、灭菌容器、麦氏比浊管(MacFarland No.1)、离心管（具
备防气溶胶功能）等。
7 培养基、药物纯品、药物溶液保存
7.1 培养基保存
自制的或者商品化的含药培养基和对照培养基，应抽取5%进行无菌试验，（36±1） ℃孵育48h，
观察培养基颜色、质地、凝固水、匀质性及细菌污染等情况，合格者在冷藏环境下置于密封袋内保
存：自制对照培养基保存期不超过2个月，含药培养基保存期不超过1个月；商品化培养基按试剂说
明书妥善保存。
T/CHATA 037—2024
3
7.2 药物纯品保存
所获得的抗结核药物标准粉或纯粉，应按厂商提供的说明书要求予以保藏，如链霉素、乙胺丁
醇、卡那霉素、丁胺卡那等应置于干燥器内冷藏，卷曲霉素等需冷冻保存， 脂溶性药物避免使用塑
料容器保存，异烟肼则可常温保存，有条件者宜使用真空干燥器。另外，应注意确保在保质期内使
用。
7.3 药物溶液保存
对按附录D配制好的测试药物溶液的保存，遵守以下操作原则：
a) 保存总量不超过实验室半年使用量；
b) 按实验室开展检测的频度、每次检测受试菌数量适量分装药液于密封性能良好的冷冻保存
管；
c) -20 ℃以下（推荐-70℃）冷冻保存；
d) 需要避光药物避光保存（如利福平、贝达喹啉等）；
e) 每支冷冻保存管药液只使用1次，剩余药物丢弃；
f) 宜配制浓度更高的储存液（ ≥ 1000μg/mL或10倍工作液浓度）。
8 受试菌选择
8.1 总体原则
宜尽量使用初代分离培养物进行DST；若初代培养物不符合要求，应用二次传代培养物进行DST；
受试菌样品在2 ℃～8 ℃保存超过1周者需要二次传代后进行DST。
8.2 直接应用初代分离菌株
初代分离菌株符合以下要求者可直接应用：
a) 固体培养基出现肉眼可见菌落后或采用液体培养基的自动化分枝杆菌培养系统报阳后，置
恒温培养箱内（36±1 ）℃孵育1周～2周的新鲜菌落或细菌生长量达到1麦氏浊度的菌液；
b) 没有其他污染菌共存；
c) 菌种鉴定确认为结核分枝杆菌。
8.3 需要二次传代培养的菌株
确认为结核分枝杆菌，但固体培养基出现干燥或裂缝现象、菌落干燥或变硬者、采用液体培养
基的自动化分枝杆菌培养系统报阳后置恒温培养箱内（36±1 ）℃孵育1周～2周细菌生长量达不到1
麦氏浊度者、肉眼或涂片染色后镜下观察到其他细菌污染者，需要将培养物进行二次传代后进行DST。
二次传代培养方法同分枝杆菌分离培养，接种物处理原则如下：
T/CHATA 037—2024
4
a) 对无污染者，挑取典型菌落直接接种或加少量生理盐水制成均匀菌液后接种；
b) 对有污染者，用少量2%～4%氢氧化钠溶液进行去污染处理，以获得分枝杆菌的纯培养物后
接种。
9 菌悬液制备与菌液稀释
9.1 菌悬液制备
9.1.1 磨菌瓶法制备固体培养基分离菌菌悬液
主要包括如下试验步骤。
a) 磨菌瓶高压灭菌。在瓶内放置10颗左右约3 mm大小的小玻璃珠，旋好螺旋盖后高压灭菌。
b) 受试菌挑选。在磨菌瓶中加入10%吐温-80或生理盐水2滴~3滴，用无菌吸管尖端或灭菌接种
环在培养基斜面多处刮取2周～3周的新鲜菌落置于磨菌瓶中，旋紧瓶盖。
c) 受试菌处理。将磨菌瓶置于涡旋振荡器上混旋成细菌匀浆，静置15 min，加入约2 mL灭菌
PBS缓冲液（PH7.4）或生理盐水，轻轻混匀，静置菌液15 min，待大块菌沉淀后，无菌转
移上部菌液约1mL至另一无菌试管中。
d) 菌悬液比浊。与麦氏比浊管(MacFarland No.1）比浊，逐滴加入灭菌生理盐水，至菌液浊
度与麦氏1号比浊管一致，即得1 mg/mL受试菌悬液。
9.1.2 细菌超声分散计数仪法制备固体培养基分离菌菌悬液
采用已灭菌的接种环在培养基斜面多处刮取2周～3周的新鲜菌落1环，放入预先加有约2 mL生理
盐水的超声分散仪专用试管中，然后将该试管放入分散仪中进行超声分散；根据仪器提示加入相应
体积稀释液，将菌悬液稀释至1麦氏浊度。对超声分散效果不好者可采用研磨瓶预处理（如先进行玻
璃珠涡旋振荡后再超声分散）。
9.1.3 液体培养基分离菌菌悬液制备
从目前临床实验室分枝杆菌培养方法来看，主要指自动化分枝杆菌培养系统的培养物，操作程
序为：阳性瓶3000g/min离心沉淀15 min后取0.5 mL沉淀物加入磨菌瓶中，将磨菌瓶置于涡旋振荡器
上混旋，加入2mL～3mL生理盐水混旋、静置，待大颗粒菌沉淀后，转移中上部菌液约2mL到另一无菌
试管中，菌悬液比浊同磨菌瓶法。
9.2 菌液稀释
9.2.1 终浓度为10-2 mg/mL测试菌液制备
用22 SWG标准接种环取2满环或微量吸管吸取20μL的1 mg／mL菌悬液，加入到2mL的无菌生理盐
水中混匀。
T/CHATA 037—2024
5
9.2.2 终浓度为10-4 mg/mL测试菌液制备
用同样方法对10-2 mg／mL测试菌液进行100倍稀释。
10 接种与培养
10.1 接种
用22 SWG标准接种环分别醮取1满环(即0.01 mL)10-2 mg／mL和10-4 mg/mL测试菌液，用划线法
分别均匀接种至L-J或琼脂含药培养基和对照培养基斜面上，7H10培养基和7H11培养基在划线接种后
采用涂布棒均匀涂布在平板上，最终接种菌量为10-4 mg和10-6 mg。
注：将菌液尽可能均匀分散于培养基上静置几分钟，使之均匀渗入培养基。
10.2 培养
将接种好的L-J培养基置于培养基斜面放置架，置入（36±1 ）℃恒温培养箱内培养24 h后直
立放置，或将接种好的7H10和7H11平板放置入5%的二氧化碳孵育箱（36±1 ）℃孵育，接种后第3
天观察1次，以便及时发现可能的污染情况，及早进行重复试验，满4周报告结果。
11 结果记录、判读与报告
11.1 结果记录
在药物敏感性试验登记本或实验室信息系统内，按《中国结核病防治工作技术指南》要求，以
“未生长（-）”“实际菌落数”“1+”“2+”“3+”“4+”和“污染”方式记录各培养基中菌落生
长情况。
11.2 结果判读
11.2.1 可以报告DST结果
结果判读原则：将两种不同浓度的结核分枝杆菌菌液分别接种于两支含相同药物浓度的培养基
和不含药的对照培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长的菌落数，计算耐药百分比，
确定测试菌株对该药的耐药性，耐药比例> 1%者视受试结核分枝杆菌对该抗结核药物耐药，≤ 1%
者则为敏感。以下两种情况可以报告结果：
a) 对照管菌落生长良好、高稀释度对照管菌落数≥ 20个、可计数对照培养基上最大可数菌
落，按（含药培养基上生长的菌落数÷ 对照培养基上生长的菌落数）× 100%计算耐药百
分比判定耐药与敏感。
b) 高、低稀释度对照管菌落生长良好但菌落数均不可数时，参照绝对浓度法判读结果，含药
培养基上菌落数≥ 20个且高、低稀释度结果一致时判定为耐药，< 20个且高、低稀释度
T/CHATA 037—2024
6
结果一致时判定为敏感。
11.2.2 重复本菌株DST
至少以下3种情况需要重复本菌株DST：
a) 怀疑污染并经抗酸染色证实；
b) 对照管菌落生长不佳、高稀释度对照管菌落数少于20个；
c) 参照绝对浓度法判读结果时高、低稀释度结果不一致。
11.3 结果报告
根据结果判读情况，及时按“敏感”“耐药”报告结果。在临床、管理上等有特定要求的情况
下考虑：
a) 在“耐药”报告中附上耐药百分比数据；
b) 对需要重复DST者，向临床出具“重复试验”的临时检测报告，并说明其原因，在获得重复
试验结果后出具正式检测报告。
12 质量控制
12.1 人员培训和技能考核
针对操作人员开展专业理论、实践技能、生物安全等内容的培训，建立考核制度，提高实验室
的检测能力。
12.2 仪器设备的质量控制
仪器设备应通过规定的性能标准，并且定期校准，设立SOP文件执行日常维护；仪器使用人应经
过培训并授权使用；仪器上设立标识卡以显示仪器检测、校准或验证状态，并预计下次校准日期。
孵育箱、蒸汽凝固器、冰箱等须进行温度控制；比浊仪或细菌超声分散计数仪使用标准管校准；称
量天平称量前须砝码校准；生物安全柜定期检测空气流速、洁净度，必要时更换高效过滤器；高压
灭菌器采用耐热的嗜热脂肪芽孢杆菌指示剂、留点温度等做质量控制。
12.3 DST前质量控制
主要包括测试药物药液配制、培养基配制与保存等的质量控制：
a) 药物称量是否准确、溶解是否充分；
b) 含药培养基制作过程中的凝固时间和温度是否严格控制；
c) 培养基外观是否呈黄绿色、硬度适中、不易碎裂、有少量凝固水、质地均匀；
d) 培养基是否做无菌生长试验；
e) 商品化培养基由厂家提供质量合格报告，报告内容包括但不限于培养基的外观、PH值、生
T/CHATA 037—2024
7
长性能、微生物限度、稳定性等，每批次应用前抽取5%进行无菌生长试验。
12.4 DST 中质量控制
主要包括受试菌选择和菌液配制、稀释、接种等操作过程的质量控制：
a) 受试菌是否为对数生长期菌落及其在菌落中的代表性；
b) 为确保菌液配制浓度准确的标准麦氏比浊管的密封保存、菌液制备比浊试管与标准麦氏比
浊管在材料、管径、管壁厚度等方面的一致性；
c) 菌液制备、稀释和接种过程中吸量操作的准确与稳定性，包括接种时应先接种低浓度菌液。
12.5 DST 后质量控制
在35 ℃～37 ℃温度波动范围的恒温培养箱进行培养，使用精确度至少为±1 ℃的温度计进
行温度监测，超过温度范围时应及时纠正或更换恒温培养箱。
12.6 质控参考菌株的使用
为检测含药培养基质量、受试菌接种量等因素，每批药敏试验加入一株参考菌株H37Rv（ATCC
27294）或者H37Ra（ATCC 25177）结核分枝杆菌作敏感对照，或者当每周多次进行检测时每周检测
1 次参考株。有条件的实验室宜建立可操作的耐药质控株质量控制体系：
a) 应用国内得到认可的耐药质控菌株或者ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株，目前可查见的ATCC
质控株编号见附录E。
b) 有条件的单位在中国疾病预防控制中心指导下，建立实验室内部耐药结核分枝杆菌质控株
资源库并应用。
13 实验室生物安全
根据《人间传染的病原微生物目录》，结核分枝杆菌常规样本检测和非泛耐药、非多耐药的菌
株传代培养、扩增培养等可在生物安全Ⅱ级实验室（bio-safety level 2,BSL-2）进行。结核分枝
杆菌固体培养基比例法DST操作应予按照《中华人民共和国生物安全法》（2024年修正）、WS 233
—2017 、WS/T 442-2014和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》
的相关管理要求进行。
T/CHATA 037—2024
8
附录A
（规范性）
结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程
图A.1 给出了结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程。
图A.1 结核分枝杆菌固体培养基比例法DST操作流程图
DST 准备DST 接种DST 培养
1 麦氏浊度菌液制备
菌悬液2 次百倍稀释
2 种稀释菌悬液接种
测试药物溶液配制
培养基制作或购买
培养基质量评估
过程观察与记录
测试结果准确判读
结果报告与解释
全过程质量控制
全方位生物安全
T/CHATA 037—2024
9
附录B
（资料性）
L-J 对照培养基和含药培养基制备
B.1 环境与仪器、器具准备
主要包括（但不限于）：清洁操作台面，预热蒸汽凝固器，调校分析天平，并按洁净与消毒要
求准备好量筒、消毒纱布、漏斗、称量勺、称量纸、棕色瓶、烧瓶、培养管、培养基斜面放置架等
器具。
B.2 基础液配制
用分析天平准确称取表B.1中的固体成分，用量筒准确量取丙三醇12 mL，置于已高压灭菌的2000
mL烧瓶中，加入600 mL蒸馏水或去离子水，沸水浴或煮沸至完全溶解，121℃ 高压灭菌20min，冷却
至室温后4 ℃冰箱保存备用。
表B.1 改良L-J 培养基组分与含量a
固体成分液体成分
成分用量（g） 成分用量（mL）
磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.4 丙三醇12
柠檬（枸橼）酸镁0.6 蒸馏水或去离子水600
硫酸镁（MgSO4•7H2O） 0.24 新鲜、无抗菌素鸡蛋匀液1000
天门冬素/谷氨酸钠3.6/7.2 孔雀绿（2%） 20
a 表中各成分含量应根据制备不同数量培养基的总体积而定，按比例增减，7H10/7H11培养基制备同此。
B.3 孔雀绿溶液配制
准确称量孔雀绿染料2.0 g，溶于100 mL无菌蒸馏水中，37℃温箱放置1 h～2 h助溶。孔雀绿
液不能长期保存，如出现沉淀或颜色变浅，应废弃并重新制备。
B.4 新鲜鸡蛋匀液制备
B.4.1 购买符合质量要求的鸡蛋
T/CHATA 037—2024
10
鸡蛋质量要求如下：
a) 保存期不超过7d;
b) 产蛋鸡不应饲喂含抗生素饲料。
B.4.2 鸡蛋清洁消毒
用温水或普通碱性肥皂彻底刷洗干净后，在适当容器内用75%乙醇中浸泡消毒20 min～30 min，
晾干。
B.4.3 全卵液匀化
主要操作包括：
a) 将消毒晾干的鸡蛋打入灭菌的小烧杯内，新鲜蛋液转入2000 mL无菌烧杯内；
b) 待卵液略超过1000 mL后，使用打蛋器或搅拌器匀化卵液；
c) 用无菌双层纱布过滤匀化卵液于另一2000 mL无菌烧杯内，获得匀化卵液。
B.5 药物溶液取用
从冷藏冰箱取出合适用量的试验药物溶液冻存管，室温放置至完全融化（避光药物避光放置）
后待用，药物溶液配制见附录D。
B.6 培养基制备
B.6.1 对照培养基制备
主要操作包括：
a) 培养液制作：将1000 mL匀质全卵液加入至常温基础液中，再加入20 mL孔雀绿溶液，缓慢
混匀；
b) 培养液分装：分装培养基液至适宜培养管中，每管7 mL～10 mL，将培养管放置在适宜倾斜
角度的斜面架上；
c) 凝固培养基：分装后尽快将斜面架置入已经预热的蒸汽凝固器中，待凝固器温度升至85 ℃
时开始计时，凝固50 min（注意温度和时间的准确）；
d) 培养基观察与保存：凝固过程完成后，将培养管从蒸汽凝固器中取出，冷却至室温时旋紧
螺旋盖；置（36±1 ）℃孵育48h，观察培养基外观与细菌生长情况，合格者在冷藏环境下
置于密封袋内保存。
B.6.2 含药培养基制备
除在培养液制备环节需加定量测试药物溶液外，其余操作同B.6.1。
测试药物溶液用量按以下公式计算：药物溶液用量（mL）= （含药培养药物终浓度÷ 药物溶
液浓度）× 培养基液总体积（mL）。
T/CHATA 037—2024
11
附录C
（资料性）
7H10/7H11 对照培养基和含药培养基制备
C.1 环境与仪器、器具准备
主要包括（但不限于）：清洁操作台面，调校分析天平，并按洁净与消毒要求准备好量筒、消
毒纱布、称量勺、称量纸、烧瓶、棕色瓶、培养皿等器具。
C.2 化学组分溶液制备
用分析天平和量筒按表C.1准确称量除琼脂粉以外各化学组分，转入已消毒灭菌烧瓶，用700 mL
蒸馏水充分溶解，准确称量并加入琼脂粉补充蒸馏水至900 mL充分混匀，121℃ 高压灭菌15min～20
min后，置50℃～55 ℃水浴。
表C.1 7H10/7H11 培养基组分与含量
组分成分用量组分成分用量
化学
组分
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.5 g
化学
组分
生物素(维生素H) 0.0005 g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5 g 孔雀绿0.001 g
硫酸氨[(NH4)2SO4•7H2O] 0.5 g 琼脂粉15.0 g
氯化钙(CaCl2•2H2O) 0.0005 g 甘油5.0 mL
硫酸锌(ZnSO4•7H2O) 0.001 g 吐温80 0.5 mL
硫酸铜(CuSO4•5H2O) 0.001 g
营养
增强剂
油酸0.5 g
L-谷氨酸钠0.5 g 牛血清白蛋白Ⅴ 50.0g
枸橼酸三钠(Na3C6H5O7•2H2O) 0.4 g 催化酶(过氧化氢酶) 0.3 g
枸橼酸铁铵0.04 g 葡萄糖20.0 g
盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.001 g 酪蛋白水解物a 1.0 g
a 仅配制7H11使用，7H10时无此组分。
C.3 营养增强剂组分溶液制备
用分析天平准确称取营养增强剂组分溶于800 mL生理盐水中，充分溶解后用6 mol/L NaOH 或1
mol/L HCl 调整溶液pH 至6.4～6.8（25 ℃），补充生理盐水至1000 mL，使用微孔滤膜或滤器（孔
径≤ 0.22 μm)除菌。
T/CHATA 037—2024
12
C.4 药物溶液取用
同B.5。
C.5 培养基制备
C.5.1 对照培养基制备
通过无菌操作取50℃～55 ℃水浴化学组分溶液900 mL，加入100 mL营养增强剂组分溶液充分
混合，分装混匀液至适宜培养皿中，每皿7 mL～10mL，将培养皿平放在适宜的盛盆中，置室温凝固，
待培养基凝固后，置（36±1 ）℃孵育48 h，观察培养基外观与细菌生长情况，合格者在冷藏环境
下置于密封袋内保存。
C.5.2 含药培养基制备
混匀900 mL化学组分溶液、100 mL营养增强剂组分溶液、定量测试药物溶液，操作同C.5.1。
测试药物溶液用量按以下公式计算：药物溶液用量（mL）= （含药培养药物终浓度÷ 药物溶
液浓度）× 培养基液总体积（mL）。
T/CHATA 037—2024
13
附录D
（资料性）
结核分枝杆菌体外药物敏感性试验测试药物溶液配制
D.1 不同培养基、不同药物DST结果判定指示浓度和测试药物溶液配制浓度的设置
目前，以世界卫生组织（WHO）为主导，以临界浓度（CC）和临床折点（CB）的科学研究数据
为主要依据，设置了多种抗结核药物不同固体培养基DST结果判定的指示浓度，一般按100倍培养基
内终浓度配制测试药物溶液保存液（见表D.1）。
表D.1 结核分枝杆菌比例法DST 配制药液浓度和培养基药物终浓度
药物
L-J 培养基7H10 培养基7H11 培养基
药液浓度药物溶剂
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
药液浓度
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
药液浓度
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
利福平4000 40.0 100 1.0 100 1.0
二甲基甲酰
胺
异烟肼20 0.2 20 0.2 20 0.2 灭菌蒸馏水
乙胺丁醇200 2.0 500 5.0 750 7.5 灭菌蒸馏水
左氧氟沙
星
200 2.0 100 1.0 — — 1%NaOH
莫西沙星100 1.0 50 0.5 50 0.5 1%NaOH
莫西沙星a — — 200 2.0 — — 1%NaOH
贝达喹啉— — — — 25 0.25
二甲基甲酰
胺
利奈唑胺— — 100 1.0 100 1.0 灭菌蒸馏水
德拉马尼— — — — 16 0.16
二甲基甲酰
胺
阿米卡星3000 30.0 200 2.0 — — 灭菌蒸馏水
链霉素400 4.0 200 2.0 200 2.0 灭菌蒸馏水
T/CHATA 037—2024
14
乙硫异烟
胺
4000 40.0 500 5.0 1000 10.0
二甲基甲酰
胺
丙硫异烟
胺
4000 40.0 — — — —
二甲基甲酰
胺
对氨基水
杨酸
100 1.0 — — — — 灭菌蒸馏水
a 为CB，未标注者为CC；“—”者表示DST方法尚未建立。
D.2 测试药物溶液配制
D.2.1 用药量计算
为减少称量误差，每次应至少称重10 mg，用药量计算公式如下：
用药量= （培养基内药物终浓度× 需制备培养基体积）÷（药物纯度× 药物效价×
1000）。
注：用药量、浓度、体积、效价与纯度单位分别为mg、g/mL、mL、%、%表示。
D.2.2 药物称量
从冰箱内取出测试药物，为避免冷凝水的影响，先恢复至室温再打开包装；将无菌容器置于灵
敏度不小于0.0001 g的天平上，将天平调零后，加入药品按用药量称量。
D.2.3 药物溶解和制备
脂溶性药物先用少量二甲基甲酰胺溶解，喹诺酮类用少量1%NaOH溶解，然后加灭菌蒸馏水至所
需要体积，其他水溶性药物则可直接应用灭菌蒸馏水溶解并加到至所需要体积。
D.2.4 药物溶液保存
依试验开展频度、每次测试样本数量适量分装药液于密封性能良好的冷冻保存管-20 ℃以下冷
冻保存（需要避光者避光保存），每支冷冻保存管药液只供1次试验使用，不能反复冻融。
T/CHATA 037—2024
15
附录E
（资料性）
ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株
目前可查见的ATCC耐药结核分枝杆菌质控参考株种类见表E.1。
表E.1 ATCC 耐药结核分枝杆菌质控参考株
所耐药物ATCC 编号所耐药物ATCC 编号
利福平
35821
链霉素
35820
35838 35821
700457 35823
异烟肼
35821 35825
35822 35831
35823 35832
35825 35833
35835 35834
吡嗪酰胺35828 35836
乙胺丁醇
35821
对氨基水杨酸
35821
35837 35824
卡那霉素
35821 35825
35827 乙硫异烟胺35830
环丝氨酸
35821 氨硫脲35829
35827 利福喷汀/利福布汀700457
T/CHATA 037—2024
16
参考文献
[1] GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求
[2] 人间传染的病原微生物目录（国卫科教发[2023]24号）
[3] 赵雁林,逄宇.结核病实验室检验规程[M].北京:人民卫生出版社,2015.
[4] 王辉,马筱玲,钱渊,等.临床微生物学手册(第12版第一卷)[M].北京:中华医学电子音像出
版社,2021.
[5] 赵雁林,陈明亭.中国结核病防治技术指南[M].北京:人民卫生出版社,2021.
[6] 唐神结,高文.临床结核病学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2019.
[7] World Health Organization.Guidance for the surveillance of drug resistance in
tuberculosis, sixth edition.Geneva: World Health Organization,2020.
[8] World Health Organization.Technical manual for drug susceptibility testing of
medicines used in the treatment of tuberculosis. Geneva: World Health Organization;
2018.Available from: https://www.who.int/tb/publications/2018/ WHO_ technical_drug_
susceptibility_testing/en/
[9] World Health Organization.Technical report on critical concentrations for drug
susceptibility testing of medicines used in the treatment of drug-resistant tuberculosis.
Geneva: World Health Organization;2018 (WHO/CDS/TB/2018.5) (http://apps.who.int/iris/
bitstream/10665/260470/1/WHO-CDS-TB-2018.5-eng.pdf accessed 10 October 2018).
[10] The Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Susceptibility Testing of
Mycobacteria, Nocardia spp,and other Aerobic Actinomctes，M24,3nd Edition,2018.
[11] Technical manual for drug susceptibility testing of medicines used in the treatment
of tuberculosis(WHO,2018）
[12] Forbes BA,Hall GS,Miller MB,et al.Practical Guidance for Clinical Microbiology
Laboratories: Mycobacteria[J].Clin Microbiol Rev,2018,31(2):e00038-17.
ICS 11.020
CCS C 05
T/CHATA 037—2024 基于固体培养基的结核分枝杆菌比例法药物敏感性试验操作规范
The guideline on operation of solid medium-based proportionmethod for drug sensitivity testing of mycobacterium tuberculosis
2024-06-11 发布2024-06-11 实施
中国防痨协会发布
目次
前言............................................................................ III
1 范围............................................................................. 1
2 规范性引用文件................................................................... 1
3 术语和定义....................................................................... 1
4 对象与样本........................................................................2
5 设施与设备....................................................................... 2
6 试剂与耗材....................................................................... 2
7 培养基、药物纯品、药物溶液保存................................................... 2
7.1 培养基保存................................................................. 2
7.2 药物纯品保存............................................................... 2
7.3 药物溶液保存............................................................... 3
8 受试菌选择....................................................................... 3
8.1 总体原则................................................................... 3
8.2 直接应用初代分离菌株....................................................... 3
8.3 需要二次传代培养的菌株..................................................... 3
9 菌悬液制备与菌液稀释............................................................. 4
9.1 菌悬液制备................................................................. 4
9.2 菌液稀释................................................................... 4
10 接种与培养...................................................................... 5
10.1 接种...................................................................... 5
10.2 培养...................................................................... 5
11 结果记录、判读与报告............................................................ 5
11.1 结果记录.................................................................. 5
11.2 结果判读.................................................................. 5
11.3 结果报告.................................................................. 6
12 质量控制........................................................................ 6
T/CHATA 037—2024
II
12.1 人员培训和技能考核...........................................................6
12.2 仪器设备的质量控制...........................................................6
12.3 DST 前质量控制...............................................................6
12.4 DST 中质量控制...............................................................7
12.5 DST 后质量控制...............................................................7
12.6 质控参考菌株的使用..........................................................7
13 实验室生物安全................................................................... 7
附录A (规范性) 结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程图.......................... 8
附录B (资料性) L-J 对照培养基和含药培养基制备...................................... 9
附录C (资料性) 7H10/7H11 对照培养基和含药培养基制备.............................. 111
附录D (资料性) 结核分枝杆菌体外药物敏感性试验测试药物溶液配制.................... 133
附录E (资料性) ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株........................................ 155
参考文献............................................................................16
T/CHATA 037—2024
III
前言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由广州市胸科医院、中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心、首都医科大学附属北
京胸科医院共同提出。
本文件由中国防痨协会归口。
本文件起草单位：广州市胸科医院、中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心、首都医科大
学附属北京胸科医院、同济大学附属上海市肺科医院、中国人民解放军总医院第八医学中心、重庆
市公共卫生医疗救治中心、天津市海河医院、山东省公共卫生临床中心。
本文件主要起草人：刘志辉、欧喜超、黄海荣、余方友、吴雪琼、王静、孙海柏、邓云峰、刘
健雄、胡锦兴、夏辉、姜广路、于霞、宛宝山、梁艳、张丽霞、王俊玲、蔡杏珊、胡族琼、王琪、
孟繁荣、关平、刘欣、牛群、苏碧仪、罗春明、曹智忠。
T/CHATA 037—2024
1
基于固体培养基的结核分枝杆菌比例法
药物敏感性试验操作规范
1 范围
本文件规定了应用固体培养基进行结核分枝杆菌比例法药物敏感试验的技术要求和操作规范。
本文件适用于我国各级疾病预防控制机构、结核病定点医疗机构、基层医疗卫生机构、综合医
疗机构和其他相关机构参照国家生物安全执行的医学实验室开展的结核分枝杆菌分离株对常用抗结
核药物敏感性的体外定性检测工作。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用
文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
适用于本文件。
WS 233-2017 病原微生物实验室生物安全通用准则
WS/T 442-2014 临床实验室生物安全指南
T/CECS 662-2020 医学生物安全二级实验室建筑技术标准
中华人民共和国生物安全法（2024年修正）
可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定(卫生部令[2005]45号)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
药物敏感性试验drug sensitivity testing ；DST
检测微生物（本文件特指结核分枝杆菌）对抗微生物药物（本文件特指抗结核药物）的体外敏
感性试验，以指导临床合理用药。
3.2
最小抑菌浓度minimal inhibitory concentration；MIC
体外药物敏感性测试中能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度，用于定量测定体外抗菌活性。
3.3
T/CHATA 037—2024
2
临界浓度critical concentration；CC
抗结核药物在体外能够抑制99%野生型结核分枝杆菌生长的最低浓度。
3.4
临床折点clinical breakpoint；CB
基于临床结果数据、MIC分布、遗传标记物和包括药物剂量在内的药动学-药效学数据的相关性
决定的、用于区分对治疗可能有无反应的高于临界浓度的MIC。
注：临床折点用于指导患者治疗中的个人临床决策，但不适用于耐药性监测目的。
4 对象与样本
检测对象主要包括诊断或治疗过程中病原学阳性的结核病患者，检测样本为液体培养或固体培
养阳性并鉴定为结核分枝杆菌的初次分离纯培养物或者次代转种纯培养物，具体检测流程按附录A。
5 设施与设备
按T/CECS 662—2020建设生物安全Ⅱ级实验室，实验室应配备有Ⅱ级生物安全柜和高压蒸汽灭
菌器等生物安全设备，同时配备恒温培养箱、涡旋振荡器、普通冰箱(2℃～8 ℃)、微量可调移液器
(10μL、100μL、1000 μL)、比浊仪或细菌超声分散计数仪等。
6 试剂与耗材
宜使用自制或商品化的改良中性罗氏（L-J）培养基，也可根据试验需求选择琼脂培养基（如
Middle brook 7H10、Middle brook 7H11）等，但应注意：药物应为具有效价、纯度标识的药物标
准粉或纯粉，不同培养基其含药浓度可能不同（见附录B和附录C）。
耗材主要包括22 SWG标准接种环、涂布棒、微量带滤芯吸嘴(10μL、100μL、1000μL)、灭菌
磨菌瓶（带有玻璃珠的无菌螺旋盖小瓶）、灭菌容器、麦氏比浊管(MacFarland No.1)、离心管（具
备防气溶胶功能）等。
7 培养基、药物纯品、药物溶液保存
7.1 培养基保存
自制的或者商品化的含药培养基和对照培养基，应抽取5%进行无菌试验，（36±1） ℃孵育48h，
观察培养基颜色、质地、凝固水、匀质性及细菌污染等情况，合格者在冷藏环境下置于密封袋内保
存：自制对照培养基保存期不超过2个月，含药培养基保存期不超过1个月；商品化培养基按试剂说
明书妥善保存。
T/CHATA 037—2024
3
7.2 药物纯品保存
所获得的抗结核药物标准粉或纯粉，应按厂商提供的说明书要求予以保藏，如链霉素、乙胺丁
醇、卡那霉素、丁胺卡那等应置于干燥器内冷藏，卷曲霉素等需冷冻保存， 脂溶性药物避免使用塑
料容器保存，异烟肼则可常温保存，有条件者宜使用真空干燥器。另外，应注意确保在保质期内使
用。
7.3 药物溶液保存
对按附录D配制好的测试药物溶液的保存，遵守以下操作原则：
a) 保存总量不超过实验室半年使用量；
b) 按实验室开展检测的频度、每次检测受试菌数量适量分装药液于密封性能良好的冷冻保存
管；
c) -20 ℃以下（推荐-70℃）冷冻保存；
d) 需要避光药物避光保存（如利福平、贝达喹啉等）；
e) 每支冷冻保存管药液只使用1次，剩余药物丢弃；
f) 宜配制浓度更高的储存液（ ≥ 1000μg/mL或10倍工作液浓度）。
8 受试菌选择
8.1 总体原则
宜尽量使用初代分离培养物进行DST；若初代培养物不符合要求，应用二次传代培养物进行DST；
受试菌样品在2 ℃～8 ℃保存超过1周者需要二次传代后进行DST。
8.2 直接应用初代分离菌株
初代分离菌株符合以下要求者可直接应用：
a) 固体培养基出现肉眼可见菌落后或采用液体培养基的自动化分枝杆菌培养系统报阳后，置
恒温培养箱内（36±1 ）℃孵育1周～2周的新鲜菌落或细菌生长量达到1麦氏浊度的菌液；
b) 没有其他污染菌共存；
c) 菌种鉴定确认为结核分枝杆菌。
8.3 需要二次传代培养的菌株
确认为结核分枝杆菌，但固体培养基出现干燥或裂缝现象、菌落干燥或变硬者、采用液体培养
基的自动化分枝杆菌培养系统报阳后置恒温培养箱内（36±1 ）℃孵育1周～2周细菌生长量达不到1
麦氏浊度者、肉眼或涂片染色后镜下观察到其他细菌污染者，需要将培养物进行二次传代后进行DST。
二次传代培养方法同分枝杆菌分离培养，接种物处理原则如下：
T/CHATA 037—2024
4
a) 对无污染者，挑取典型菌落直接接种或加少量生理盐水制成均匀菌液后接种；
b) 对有污染者，用少量2%～4%氢氧化钠溶液进行去污染处理，以获得分枝杆菌的纯培养物后
接种。
9 菌悬液制备与菌液稀释
9.1 菌悬液制备
9.1.1 磨菌瓶法制备固体培养基分离菌菌悬液
主要包括如下试验步骤。
a) 磨菌瓶高压灭菌。在瓶内放置10颗左右约3 mm大小的小玻璃珠，旋好螺旋盖后高压灭菌。
b) 受试菌挑选。在磨菌瓶中加入10%吐温-80或生理盐水2滴~3滴，用无菌吸管尖端或灭菌接种
环在培养基斜面多处刮取2周～3周的新鲜菌落置于磨菌瓶中，旋紧瓶盖。
c) 受试菌处理。将磨菌瓶置于涡旋振荡器上混旋成细菌匀浆，静置15 min，加入约2 mL灭菌
PBS缓冲液（PH7.4）或生理盐水，轻轻混匀，静置菌液15 min，待大块菌沉淀后，无菌转
移上部菌液约1mL至另一无菌试管中。
d) 菌悬液比浊。与麦氏比浊管(MacFarland No.1）比浊，逐滴加入灭菌生理盐水，至菌液浊
度与麦氏1号比浊管一致，即得1 mg/mL受试菌悬液。
9.1.2 细菌超声分散计数仪法制备固体培养基分离菌菌悬液
采用已灭菌的接种环在培养基斜面多处刮取2周～3周的新鲜菌落1环，放入预先加有约2 mL生理
盐水的超声分散仪专用试管中，然后将该试管放入分散仪中进行超声分散；根据仪器提示加入相应
体积稀释液，将菌悬液稀释至1麦氏浊度。对超声分散效果不好者可采用研磨瓶预处理（如先进行玻
璃珠涡旋振荡后再超声分散）。
9.1.3 液体培养基分离菌菌悬液制备
从目前临床实验室分枝杆菌培养方法来看，主要指自动化分枝杆菌培养系统的培养物，操作程
序为：阳性瓶3000g/min离心沉淀15 min后取0.5 mL沉淀物加入磨菌瓶中，将磨菌瓶置于涡旋振荡器
上混旋，加入2mL～3mL生理盐水混旋、静置，待大颗粒菌沉淀后，转移中上部菌液约2mL到另一无菌
试管中，菌悬液比浊同磨菌瓶法。
9.2 菌液稀释
9.2.1 终浓度为10-2 mg/mL测试菌液制备
用22 SWG标准接种环取2满环或微量吸管吸取20μL的1 mg／mL菌悬液，加入到2mL的无菌生理盐
水中混匀。
T/CHATA 037—2024
5
9.2.2 终浓度为10-4 mg/mL测试菌液制备
用同样方法对10-2 mg／mL测试菌液进行100倍稀释。
10 接种与培养
10.1 接种
用22 SWG标准接种环分别醮取1满环(即0.01 mL)10-2 mg／mL和10-4 mg/mL测试菌液，用划线法
分别均匀接种至L-J或琼脂含药培养基和对照培养基斜面上，7H10培养基和7H11培养基在划线接种后
采用涂布棒均匀涂布在平板上，最终接种菌量为10-4 mg和10-6 mg。
注：将菌液尽可能均匀分散于培养基上静置几分钟，使之均匀渗入培养基。
10.2 培养
将接种好的L-J培养基置于培养基斜面放置架，置入（36±1 ）℃恒温培养箱内培养24 h后直
立放置，或将接种好的7H10和7H11平板放置入5%的二氧化碳孵育箱（36±1 ）℃孵育，接种后第3
天观察1次，以便及时发现可能的污染情况，及早进行重复试验，满4周报告结果。
11 结果记录、判读与报告
11.1 结果记录
在药物敏感性试验登记本或实验室信息系统内，按《中国结核病防治工作技术指南》要求，以
“未生长（-）”“实际菌落数”“1+”“2+”“3+”“4+”和“污染”方式记录各培养基中菌落生
长情况。
11.2 结果判读
11.2.1 可以报告DST结果
结果判读原则：将两种不同浓度的结核分枝杆菌菌液分别接种于两支含相同药物浓度的培养基
和不含药的对照培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长的菌落数，计算耐药百分比，
确定测试菌株对该药的耐药性，耐药比例> 1%者视受试结核分枝杆菌对该抗结核药物耐药，≤ 1%
者则为敏感。以下两种情况可以报告结果：
a) 对照管菌落生长良好、高稀释度对照管菌落数≥ 20个、可计数对照培养基上最大可数菌
落，按（含药培养基上生长的菌落数÷ 对照培养基上生长的菌落数）× 100%计算耐药百
分比判定耐药与敏感。
b) 高、低稀释度对照管菌落生长良好但菌落数均不可数时，参照绝对浓度法判读结果，含药
培养基上菌落数≥ 20个且高、低稀释度结果一致时判定为耐药，< 20个且高、低稀释度
T/CHATA 037—2024
6
结果一致时判定为敏感。
11.2.2 重复本菌株DST
至少以下3种情况需要重复本菌株DST：
a) 怀疑污染并经抗酸染色证实；
b) 对照管菌落生长不佳、高稀释度对照管菌落数少于20个；
c) 参照绝对浓度法判读结果时高、低稀释度结果不一致。
11.3 结果报告
根据结果判读情况，及时按“敏感”“耐药”报告结果。在临床、管理上等有特定要求的情况
下考虑：
a) 在“耐药”报告中附上耐药百分比数据；
b) 对需要重复DST者，向临床出具“重复试验”的临时检测报告，并说明其原因，在获得重复
试验结果后出具正式检测报告。
12 质量控制
12.1 人员培训和技能考核
针对操作人员开展专业理论、实践技能、生物安全等内容的培训，建立考核制度，提高实验室
的检测能力。
12.2 仪器设备的质量控制
仪器设备应通过规定的性能标准，并且定期校准，设立SOP文件执行日常维护；仪器使用人应经
过培训并授权使用；仪器上设立标识卡以显示仪器检测、校准或验证状态，并预计下次校准日期。
孵育箱、蒸汽凝固器、冰箱等须进行温度控制；比浊仪或细菌超声分散计数仪使用标准管校准；称
量天平称量前须砝码校准；生物安全柜定期检测空气流速、洁净度，必要时更换高效过滤器；高压
灭菌器采用耐热的嗜热脂肪芽孢杆菌指示剂、留点温度等做质量控制。
12.3 DST前质量控制
主要包括测试药物药液配制、培养基配制与保存等的质量控制：
a) 药物称量是否准确、溶解是否充分；
b) 含药培养基制作过程中的凝固时间和温度是否严格控制；
c) 培养基外观是否呈黄绿色、硬度适中、不易碎裂、有少量凝固水、质地均匀；
d) 培养基是否做无菌生长试验；
e) 商品化培养基由厂家提供质量合格报告，报告内容包括但不限于培养基的外观、PH值、生
T/CHATA 037—2024
7
长性能、微生物限度、稳定性等，每批次应用前抽取5%进行无菌生长试验。
12.4 DST 中质量控制
主要包括受试菌选择和菌液配制、稀释、接种等操作过程的质量控制：
a) 受试菌是否为对数生长期菌落及其在菌落中的代表性；
b) 为确保菌液配制浓度准确的标准麦氏比浊管的密封保存、菌液制备比浊试管与标准麦氏比
浊管在材料、管径、管壁厚度等方面的一致性；
c) 菌液制备、稀释和接种过程中吸量操作的准确与稳定性，包括接种时应先接种低浓度菌液。
12.5 DST 后质量控制
在35 ℃～37 ℃温度波动范围的恒温培养箱进行培养，使用精确度至少为±1 ℃的温度计进
行温度监测，超过温度范围时应及时纠正或更换恒温培养箱。
12.6 质控参考菌株的使用
为检测含药培养基质量、受试菌接种量等因素，每批药敏试验加入一株参考菌株H37Rv（ATCC
27294）或者H37Ra（ATCC 25177）结核分枝杆菌作敏感对照，或者当每周多次进行检测时每周检测
1 次参考株。有条件的实验室宜建立可操作的耐药质控株质量控制体系：
a) 应用国内得到认可的耐药质控菌株或者ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株，目前可查见的ATCC
质控株编号见附录E。
b) 有条件的单位在中国疾病预防控制中心指导下，建立实验室内部耐药结核分枝杆菌质控株
资源库并应用。
13 实验室生物安全
根据《人间传染的病原微生物目录》，结核分枝杆菌常规样本检测和非泛耐药、非多耐药的菌
株传代培养、扩增培养等可在生物安全Ⅱ级实验室（bio-safety level 2,BSL-2）进行。结核分枝
杆菌固体培养基比例法DST操作应予按照《中华人民共和国生物安全法》（2024年修正）、WS 233
—2017 、WS/T 442-2014和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》
的相关管理要求进行。
T/CHATA 037—2024
8
附录A
（规范性）
结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程
图A.1 给出了结核分枝杆菌固体培养基比例法DST 操作流程。
图A.1 结核分枝杆菌固体培养基比例法DST操作流程图
DST 准备DST 接种DST 培养
1 麦氏浊度菌液制备
菌悬液2 次百倍稀释
2 种稀释菌悬液接种
测试药物溶液配制
培养基制作或购买
培养基质量评估
过程观察与记录
测试结果准确判读
结果报告与解释
全过程质量控制
全方位生物安全
T/CHATA 037—2024
9
附录B
（资料性）
L-J 对照培养基和含药培养基制备
B.1 环境与仪器、器具准备
主要包括（但不限于）：清洁操作台面，预热蒸汽凝固器，调校分析天平，并按洁净与消毒要
求准备好量筒、消毒纱布、漏斗、称量勺、称量纸、棕色瓶、烧瓶、培养管、培养基斜面放置架等
器具。
B.2 基础液配制
用分析天平准确称取表B.1中的固体成分，用量筒准确量取丙三醇12 mL，置于已高压灭菌的2000
mL烧瓶中，加入600 mL蒸馏水或去离子水，沸水浴或煮沸至完全溶解，121℃ 高压灭菌20min，冷却
至室温后4 ℃冰箱保存备用。
表B.1 改良L-J 培养基组分与含量a
固体成分液体成分
成分用量（g） 成分用量（mL）
磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.4 丙三醇12
柠檬（枸橼）酸镁0.6 蒸馏水或去离子水600
硫酸镁（MgSO4•7H2O） 0.24 新鲜、无抗菌素鸡蛋匀液1000
天门冬素/谷氨酸钠3.6/7.2 孔雀绿（2%） 20
a 表中各成分含量应根据制备不同数量培养基的总体积而定，按比例增减，7H10/7H11培养基制备同此。
B.3 孔雀绿溶液配制
准确称量孔雀绿染料2.0 g，溶于100 mL无菌蒸馏水中，37℃温箱放置1 h～2 h助溶。孔雀绿
液不能长期保存，如出现沉淀或颜色变浅，应废弃并重新制备。
B.4 新鲜鸡蛋匀液制备
B.4.1 购买符合质量要求的鸡蛋
T/CHATA 037—2024
10
鸡蛋质量要求如下：
a) 保存期不超过7d;
b) 产蛋鸡不应饲喂含抗生素饲料。
B.4.2 鸡蛋清洁消毒
用温水或普通碱性肥皂彻底刷洗干净后，在适当容器内用75%乙醇中浸泡消毒20 min～30 min，
晾干。
B.4.3 全卵液匀化
主要操作包括：
a) 将消毒晾干的鸡蛋打入灭菌的小烧杯内，新鲜蛋液转入2000 mL无菌烧杯内；
b) 待卵液略超过1000 mL后，使用打蛋器或搅拌器匀化卵液；
c) 用无菌双层纱布过滤匀化卵液于另一2000 mL无菌烧杯内，获得匀化卵液。
B.5 药物溶液取用
从冷藏冰箱取出合适用量的试验药物溶液冻存管，室温放置至完全融化（避光药物避光放置）
后待用，药物溶液配制见附录D。
B.6 培养基制备
B.6.1 对照培养基制备
主要操作包括：
a) 培养液制作：将1000 mL匀质全卵液加入至常温基础液中，再加入20 mL孔雀绿溶液，缓慢
混匀；
b) 培养液分装：分装培养基液至适宜培养管中，每管7 mL～10 mL，将培养管放置在适宜倾斜
角度的斜面架上；
c) 凝固培养基：分装后尽快将斜面架置入已经预热的蒸汽凝固器中，待凝固器温度升至85 ℃
时开始计时，凝固50 min（注意温度和时间的准确）；
d) 培养基观察与保存：凝固过程完成后，将培养管从蒸汽凝固器中取出，冷却至室温时旋紧
螺旋盖；置（36±1 ）℃孵育48h，观察培养基外观与细菌生长情况，合格者在冷藏环境下
置于密封袋内保存。
B.6.2 含药培养基制备
除在培养液制备环节需加定量测试药物溶液外，其余操作同B.6.1。
测试药物溶液用量按以下公式计算：药物溶液用量（mL）= （含药培养药物终浓度÷ 药物溶
液浓度）× 培养基液总体积（mL）。
T/CHATA 037—2024
11
附录C
（资料性）
7H10/7H11 对照培养基和含药培养基制备
C.1 环境与仪器、器具准备
主要包括（但不限于）：清洁操作台面，调校分析天平，并按洁净与消毒要求准备好量筒、消
毒纱布、称量勺、称量纸、烧瓶、棕色瓶、培养皿等器具。
C.2 化学组分溶液制备
用分析天平和量筒按表C.1准确称量除琼脂粉以外各化学组分，转入已消毒灭菌烧瓶，用700 mL
蒸馏水充分溶解，准确称量并加入琼脂粉补充蒸馏水至900 mL充分混匀，121℃ 高压灭菌15min～20
min后，置50℃～55 ℃水浴。
表C.1 7H10/7H11 培养基组分与含量
组分成分用量组分成分用量
化学
组分
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.5 g
化学
组分
生物素(维生素H) 0.0005 g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5 g 孔雀绿0.001 g
硫酸氨[(NH4)2SO4•7H2O] 0.5 g 琼脂粉15.0 g
氯化钙(CaCl2•2H2O) 0.0005 g 甘油5.0 mL
硫酸锌(ZnSO4•7H2O) 0.001 g 吐温80 0.5 mL
硫酸铜(CuSO4•5H2O) 0.001 g
营养
增强剂
油酸0.5 g
L-谷氨酸钠0.5 g 牛血清白蛋白Ⅴ 50.0g
枸橼酸三钠(Na3C6H5O7•2H2O) 0.4 g 催化酶(过氧化氢酶) 0.3 g
枸橼酸铁铵0.04 g 葡萄糖20.0 g
盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.001 g 酪蛋白水解物a 1.0 g
a 仅配制7H11使用，7H10时无此组分。
C.3 营养增强剂组分溶液制备
用分析天平准确称取营养增强剂组分溶于800 mL生理盐水中，充分溶解后用6 mol/L NaOH 或1
mol/L HCl 调整溶液pH 至6.4～6.8（25 ℃），补充生理盐水至1000 mL，使用微孔滤膜或滤器（孔
径≤ 0.22 μm)除菌。
T/CHATA 037—2024
12
C.4 药物溶液取用
同B.5。
C.5 培养基制备
C.5.1 对照培养基制备
通过无菌操作取50℃～55 ℃水浴化学组分溶液900 mL，加入100 mL营养增强剂组分溶液充分
混合，分装混匀液至适宜培养皿中，每皿7 mL～10mL，将培养皿平放在适宜的盛盆中，置室温凝固，
待培养基凝固后，置（36±1 ）℃孵育48 h，观察培养基外观与细菌生长情况，合格者在冷藏环境
下置于密封袋内保存。
C.5.2 含药培养基制备
混匀900 mL化学组分溶液、100 mL营养增强剂组分溶液、定量测试药物溶液，操作同C.5.1。
测试药物溶液用量按以下公式计算：药物溶液用量（mL）= （含药培养药物终浓度÷ 药物溶
液浓度）× 培养基液总体积（mL）。
T/CHATA 037—2024
13
附录D
（资料性）
结核分枝杆菌体外药物敏感性试验测试药物溶液配制
D.1 不同培养基、不同药物DST结果判定指示浓度和测试药物溶液配制浓度的设置
目前，以世界卫生组织（WHO）为主导，以临界浓度（CC）和临床折点（CB）的科学研究数据
为主要依据，设置了多种抗结核药物不同固体培养基DST结果判定的指示浓度，一般按100倍培养基
内终浓度配制测试药物溶液保存液（见表D.1）。
表D.1 结核分枝杆菌比例法DST 配制药液浓度和培养基药物终浓度
药物
L-J 培养基7H10 培养基7H11 培养基
药液浓度药物溶剂
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
药液浓度
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
药液浓度
/(μg/mL)
培养基内
终浓度
/(μg/mL)
利福平4000 40.0 100 1.0 100 1.0
二甲基甲酰
胺
异烟肼20 0.2 20 0.2 20 0.2 灭菌蒸馏水
乙胺丁醇200 2.0 500 5.0 750 7.5 灭菌蒸馏水
左氧氟沙
星
200 2.0 100 1.0 — — 1%NaOH
莫西沙星100 1.0 50 0.5 50 0.5 1%NaOH
莫西沙星a — — 200 2.0 — — 1%NaOH
贝达喹啉— — — — 25 0.25
二甲基甲酰
胺
利奈唑胺— — 100 1.0 100 1.0 灭菌蒸馏水
德拉马尼— — — — 16 0.16
二甲基甲酰
胺
阿米卡星3000 30.0 200 2.0 — — 灭菌蒸馏水
链霉素400 4.0 200 2.0 200 2.0 灭菌蒸馏水
T/CHATA 037—2024
14
乙硫异烟
胺
4000 40.0 500 5.0 1000 10.0
二甲基甲酰
胺
丙硫异烟
胺
4000 40.0 — — — —
二甲基甲酰
胺
对氨基水
杨酸
100 1.0 — — — — 灭菌蒸馏水
a 为CB，未标注者为CC；“—”者表示DST方法尚未建立。
D.2 测试药物溶液配制
D.2.1 用药量计算
为减少称量误差，每次应至少称重10 mg，用药量计算公式如下：
用药量= （培养基内药物终浓度× 需制备培养基体积）÷（药物纯度× 药物效价×
1000）。
注：用药量、浓度、体积、效价与纯度单位分别为mg、g/mL、mL、%、%表示。
D.2.2 药物称量
从冰箱内取出测试药物，为避免冷凝水的影响，先恢复至室温再打开包装；将无菌容器置于灵
敏度不小于0.0001 g的天平上，将天平调零后，加入药品按用药量称量。
D.2.3 药物溶解和制备
脂溶性药物先用少量二甲基甲酰胺溶解，喹诺酮类用少量1%NaOH溶解，然后加灭菌蒸馏水至所
需要体积，其他水溶性药物则可直接应用灭菌蒸馏水溶解并加到至所需要体积。
D.2.4 药物溶液保存
依试验开展频度、每次测试样本数量适量分装药液于密封性能良好的冷冻保存管-20 ℃以下冷
冻保存（需要避光者避光保存），每支冷冻保存管药液只供1次试验使用，不能反复冻融。
T/CHATA 037—2024
15
附录E
（资料性）
ATCC 耐药结核分枝杆菌质控株
目前可查见的ATCC耐药结核分枝杆菌质控参考株种类见表E.1。
表E.1 ATCC 耐药结核分枝杆菌质控参考株
所耐药物ATCC 编号所耐药物ATCC 编号
利福平
35821
链霉素
35820
35838 35821
700457 35823
异烟肼
35821 35825
35822 35831
35823 35832
35825 35833
35835 35834
吡嗪酰胺35828 35836
乙胺丁醇
35821
对氨基水杨酸
35821
35837 35824
卡那霉素
35821 35825
35827 乙硫异烟胺35830
环丝氨酸
35821 氨硫脲35829
35827 利福喷汀/利福布汀700457
T/CHATA 037—2024
16
参考文献
[1] GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求
[2] 人间传染的病原微生物目录（国卫科教发[2023]24号）
[3] 赵雁林,逄宇.结核病实验室检验规程[M].北京:人民卫生出版社,2015.
[4] 王辉,马筱玲,钱渊,等.临床微生物学手册(第12版第一卷)[M].北京:中华医学电子音像出
版社,2021.
[5] 赵雁林,陈明亭.中国结核病防治技术指南[M].北京:人民卫生出版社,2021.
[6] 唐神结,高文.临床结核病学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2019.
[7] World Health Organization.Guidance for the surveillance of drug resistance in
tuberculosis, sixth edition.Geneva: World Health Organization,2020.
[8] World Health Organization.Technical manual for drug susceptibility testing of
medicines used in the treatment of tuberculosis. Geneva: World Health Organization;
2018.Available from: https://www.who.int/tb/publications/2018/ WHO_ technical_drug_
susceptibility_testing/en/
[9] World Health Organization.Technical report on critical concentrations for drug
susceptibility testing of medicines used in the treatment of drug-resistant tuberculosis.
Geneva: World Health Organization;2018 (WHO/CDS/TB/2018.5) (http://apps.who.int/iris/
bitstream/10665/260470/1/WHO-CDS-TB-2018.5-eng.pdf accessed 10 October 2018).
[10] The Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Susceptibility Testing of
Mycobacteria, Nocardia spp,and other Aerobic Actinomctes，M24,3nd Edition,2018.
[11] Technical manual for drug susceptibility testing of medicines used in the treatment
of tuberculosis(WHO,2018）
[12] Forbes BA,Hall GS,Miller MB,et al.Practical Guidance for Clinical Microbiology
Laboratories: Mycobacteria[J].Clin Microbiol Rev,2018,31(2):e00038-17.