DB44/T 2715-2025 木麻黄抗青枯病新品种选育技术规程

　　广东省地方标准

　　DB44/T 2715—2025

　　木麻黄抗青枯病新品种选育技术规程

　　Code of practice on breeding of bacteria wilt-resistant cultivar of Casuarina spp.

　　2025 - 07 - 28发布

　　2025 - 10 - 28实施

　　广东省市场监督管理局 发布

　　目次

　　前言 ................................................................................. II

　　1 范围 ............................................................................... 1

　　2 规范性引用文件 ..................................................................... 1

　　3 术语和定义 ......................................................................... 1

　　4 选育材料 ........................................................................... 2

　　5 青枯菌制备 ......................................................................... 2

　　6 抗病选育 ........................................................................... 3

　　7 档案管理 ........................................................................... 6

　　附录A(规范性) 培养基成分及配制方法 ................................................. 7

　　附录B(规范性) 木麻黄青枯病抗性鉴定结果记录表 ....................................... 8

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　　II

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由广东省林业局提出并组织实施。

　　本文件由广东省林业标准化技术委员会(GD/TC 146)归口。

　　本文件起草单位：中国林业科学研究院热带林业研究所。

　　本文件主要起草人：张勇、马海宾、魏永成、孟景祥、仲崇禄。

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　　木麻黄抗青枯病新品种选育技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了木麻黄(Casuarina spp.)抗青枯病新品种选育的选育材料、青枯菌制备、抗病选育、分析评价、档案管理等技术要求。

　　本文件适用于木麻黄抗青枯病新品种的选育。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　DB44/T 1235 木麻黄栽培技术规程

　　DB44/T 2346 木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程

　　DB44/T 2414 木麻黄主要病虫害综合防治技术规程

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　青枯病 bacterial wilt

　　由青枯雷尔氏杆菌(Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.)引起的维管束病害，该病害主要由土壤传播并从根系侵入植物，大量繁殖后导致维管束被堵塞造成植物死亡。

　　抗青枯病新品种 new variety resistant to bacterial wilt

　　利用木麻黄种源、家系、杂交子代或实生苗人工林中的优良单株经无性繁殖获得无性系，再通过抗病测试定向选择培育对青枯病有较强抵抗力的新品系。

　　切枝水培接种法 pathogenic bacteria inoculation using water-culture cuttings

　　将半木质化枝条剪成15 cm～20 cm长的切枝，将其下端浸入青枯菌悬浮液体中培养一段时间后，观察切枝的发病情况，统计分析该遗传材料对青枯菌的抗病能力。

　　伤根接种法 pathogenic bacteria inoculation through wounded roots

　　把苗木的根部基质去除，修剪部分细根形成伤口，再把根部浸泡在青枯菌悬浮液中促进病菌感染，然后移栽入苗盆中继续培养，观察苗木的发病情况。

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　　4 选育材料

　　指不同来源的木麻黄遗传材料，包括从木麻黄天然分布区和主要引种区收集引进的种源/家系，或通过控制或自由授粉获得的杂交子代，或从实生苗人工林经选优后获得的个体，经生长和适应性评价，表现比均值高1个标准差以上的优良单株材料。

　　5 青枯菌制备 青枯菌鉴定与收集

　　5.1.1 病株选取

　　木麻黄青枯病发病症状为小枝黄化，稀疏，凋落，侧枝枯死或枯梢多;根系发黑，树干内木质部局部或全部变褐色;正发病植株的根、主干和侧枝横切面有乳白色至黄褐色的菌脓溢出。

　　5.1.2 快速检测

　　使用快速检测农作物青枯病常用的免疫层析试纸条对发病植株根系横切面溢出的菌脓进行检测，当试纸条出现青枯菌特征条带表明植株已经感染青枯菌。

　　5.1.3 样本采集

　　剪取青枯病症状明显但仍然存活的植株上直径粗1 cm，8 cm～10 cm长的根系，装入自封袋中并保持湿润状态，带回实验室进行菌株分离。 分离

　　5.2.1 溢出分离法

　　将发病株的根系清洗干净后剥去外皮，并用75%的酒精浸泡消毒30 s，置无菌水冲洗3次，将两端切成平整的新鲜断面，把其中一端浸泡于无菌水中，12 h～36 h后在病根的另一端断面会溢出乳白色的菌脓。用接种针挑取菌脓在TTC(2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑，见附录A.1)培养基表面划线，于30℃下恒温培养48 h。

　　5.2.2 稀释分离法

　　取发病株3 cm长的根系1条，冲洗干净表面泥土，用75%的酒精浸泡消毒30 s，无菌水冲洗3次。在超净工作台上剥去根系表皮，切除两端，再横切成3份～5份，放入含有5 mL～10 mL无菌水的培养皿内30 min，让根系的青枯菌渗出形成病菌悬浮液。用移植环蘸取菌液在TTC培养基上划线分离，于30℃下恒温培养48 h。 纯化培养

　　在培养皿内挑取不规则圆形、乳白色且中心部位淡红色的单个菌落，在TTC培养基上30℃培养36 h～48 h。 扩繁

　　将分离纯化后的青枯菌接种于CPG液体培养基(见附录A.2)，装入三角瓶中放在摇床上振荡培养，100 r/min～150 r/min，30℃培养12 h～24 h。

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　　致病性检测

　　5.5.1 伤根接种法

　　5.5.1.1 材料

　　使用2个～3个具不同抗青枯病能力的木麻黄无性系小苗(高50 cm)进行菌株致病性的检测，如易感、中等抗病和抗病的无性系。

　　5.5.1.2 接种方法

　　先用流水冲洗干净小苗根系的培养基质，剪去部分细根形成伤口。将小苗根系放入装有青枯菌悬浮液的容器中，置于30℃水浴锅中培养1 h促进青枯菌的侵染。将青枯菌悬浮液换成无菌水作为对照。

　　5.5.1.3 小苗移栽

　　接种青枯菌后将小苗移栽至育苗盘中继续生长，育苗基质用黄心土:河沙:蛭石按体积比2:2:1混合，种植株行距10 cm×10 cm。单个无性系苗每处理使用30株，重复3次以上。

　　5.5.1.4 发病率测定

　　人工接种小苗在育苗盘中生长15 d后，小苗表现萎蔫甚至干枯死亡，使用青枯病免疫检测试纸条检测根系出现青枯菌特征条带，表明木麻黄苗已发病，计算人工接种菌株小苗的发病率。发病率(Incidence rate,IR)按公式(1)计算。

　　发病率(%)=发病单株数调查单株数×100% ······················································· (1)

　　5.5.1.5 致病性判断

　　人工接种青枯菌的无性系苗达到如下发病率，可以判定该菌株为强致病性菌株，判定标准见表1。

　　表

　　1 青枯菌致病性判断

　　三种木麻黄无性系抗病等级

　　发病率(IR，%)

　　易感

　　IR≥70

　　中等抗病

　　40≤IR<70

　　抗病

　　15≤IR<40

　　5.5.2 切枝水培接种法

　　参照DB 44/T 2346执行。

　　6 抗病选育 抗病材料初选

　　6.1.1 青枯菌悬浮液制备

　　将5.4中的青枯菌液用无菌水稀释为浓度108～109 cfu/mL的悬浮液，用于木麻黄切枝水培接种。采用平板计数法计算菌液中的青枯菌数量。

　　6.1.2 切枝水培接种

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　　采集木麻黄待选优株的半木质化枝条(直径小于0.5 cm)，截成15 cm～20 cm长的切枝，确保每根切枝上带有多个小分枝。将切枝下部浸入青枯菌悬浮液中5 cm深，置于温室30℃，光照强度8000 lx的室内培养。

　　6.1.3 青枯菌接种试验设计

　　设有青枯菌接种培养和清水培养(对照)2种处理，每处理切枝30株以上，重复3次。

　　6.1.4 抗病性初选评价

　　人工接种后连续7 d观察记录切枝的发病情况，利用第7 d的数据进行发病率的统计分析。发病率使用公式(1)计算。

　　发病率小于40%的待选材料可初选为抗病材料用于下一步的抗病选育。 抗病材料复选

　　6.2.1 青枯菌悬浮液制备

　　制备方法同6.1.1。

　　6.2.2 待测材料苗木培育

　　经初选后获得的遗传材料采用嫩枝水培(或沙培)生根的方法繁殖无性系小苗，一般培养6个月高度达50 cm～70 cm后，从中选择生长健壮、根系发达、大小一致的小苗用于青枯菌接种试验。

　　6.2.3 栽培基质

　　用黄心土:河沙:蛭石按体积比2:2:1混合，加2%～3%复合肥(氮磷钾15-15-15)混匀备用。

　　6.2.4 小苗接种青枯菌

　　青枯菌接种方法同5.5.1.2。

　　6.2.5 小苗移栽

　　人工接种后的小苗移栽方法同5.5.1.3。

　　6.2.6 抗病性复选评价

　　青枯菌接种与对照处理的小苗生长15 d后，统计各待测材料的发病率和感病指数。苗木发病率使用公式(1)，感病指数(disease index, DI)参考地标DB 44/T 2414，按公式(2)计算。

　　感病指数=Σ(各病级代表数值×该级株数)调查单株数×最高病级代表数值×100 ················································ (2)

　　各病级的分级标准如下：

　　——

　　0级：苗木无发病症状;

　　——

　　1级：苗木小枝萎蔫下垂，但仍保持绿色;

　　——

　　2级：苗木小枝枯黄萎蔫但主干仍保持绿色;

　　——

　　3级：苗木完全干枯死亡。

　　发病率小于20%，或感病指数低于30的待选材料可入选为抗病品系，用于进一步的田间试验和验证。

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　　田间测定

　　6.3.1 林地选择

　　在青枯病流行区选择青枯病砍伐迹地作为田间测定的林地。共选择3块相隔至少1 km的较平坦林地，每块林地面积根据测定品系的数量确定，每品系需要面积160 m2～200 m2。

　　6.3.2 苗木培育

　　经小苗伤根接种法复选出的抗病品系，采用嫩枝水培(或沙培)的方法繁殖无性系小苗，培养6个月高度达50 cm～70 cm后用于田间试验。

　　6.3.3 田间试验设计

　　试验采用随机完全区组设计，各无性系种植10株/区组，重复4次～5次，每无性系共种植40株～50株，株行距(2～3)m ×(2～3)m。

　　6.3.4 整地和造林

　　参照DB 44/T 1235执行。

　　6.3.5 抗病性田间评价

　　6.3.5.1 病害分级描述

　　树体病害分级参考DB44/T 2414，采用6级分级标准：

　　——

　　0级：全株健康无病，小枝浓绿;

　　——

　　1级：树木长势较好，小枝枯梢或枝干有少量干枯;

　　——

　　2级：树木长势一般，三分之一枝条凋萎;

　　——

　　3级：树木长势较差，三分之一至三分之二小枝凋萎;

　　——

　　4级：树木长势差，三分之二以上小枝凋萎;

　　——

　　5级：树木完全干枯死亡。

　　6.3.5.2 青枯病发生情况调查

　　造林1年后开始观测无性系的生长性状和青枯病发生情况，连续观测5年。生长性状包括树高、胸径、干形、分枝习性等;青枯病发生包括发病率、感病指数。遇测定林被台风袭击，袭击30 d后进行一次青枯病调查。

　　6.3.5.3 抗病性评价

　　田间试验开展5年后(二分之一个轮伐期)即可进行无性系品种的抗病性评价。测定林因台风等原因青枯病大面积暴发时，抗病性评价可提前进行。采用感病指数对无性系品种进行抗病性评价，评价标准参照表2。

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　　表

　　2 木麻黄青枯病抗性的评价标准

　　感病指数(DI)分级标准

　　抗病评价

　　DI=0

　　免疫(I)

　　DI≤10

　　高抗(HR)

　　10

　　抗病(R)

　　30

　　中抗(MR)

　　50

　　感病(S)

　　DI>70

　　高感(HS) 抗病新品种评定

　　经过抗病材料初选、复选和田间测定三个选育步骤，田间多地点试验的抗病评价达到“抗病”或以上标准的木麻黄无性系，可评定为抗病新品种。

　　7 档案管理

　　建立有关青枯菌菌种、室内外试验测定等原始数据档案，主要内容包括采集地点、林分概述、分离方法、测试地点、测试条件、试验设计、田间测定林地基本情况、造林抚育、测试评价性状及主要测试结果等。

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　　A

　　A

　　附录A (规范性) 培养基成分及配制方法

　　A.1 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)培养基

　　蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，酪蛋白1 g，琼脂18 g，TTC(2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑)0.05 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值至7.0，高压灭菌锅121℃蒸汽灭菌20 min。

　　A.2 CPG(Cassamino acid-Peptone-glucose)培养基

　　蛋白胨10 g，酪朊水解物1 g，葡萄糖5 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值至7.0，高压灭菌锅121℃蒸汽灭菌20 min。

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　　B

　　B

　　附录B (规范性) 木麻黄青枯病抗性鉴定结果记录表

　　附录B.1规定了木麻黄青枯病抗性鉴定结果应记录的信息。

　　表B.1木麻黄青枯病抗性鉴定结果记录表

　　编号

　　品种/种质名称

　　来源

　　重复

　　区号

　　病情级别

　　病情

　　指数

　　平均

　　指数

　　抗性

　　评价

　　0

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　Ⅰ

　　Ⅱ

　　Ⅲ

　　接种日期：

　　调查日期：

　　调查人：

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　　广东省地方标准

　　木麻黄抗青枯病新品种选育技术规程