DB15/T 4019-2025 马肠道乳酸菌的筛选及鉴定技术规程

以下是内蒙古自治区地方标准《DB15/T 4019-2025 马肠道乳酸菌的筛选及鉴定技术规程》的详细内容总结：

​​一、范围​​

• 适用于马肠道（盲肠、结肠、直肠）内容物及黏膜中乳酸菌的分离、筛选、鉴定及保藏。
• 涵盖形态学、生化特性、分子生物学、抑菌性能及抗氧化性等综合鉴定方法。

​​二、规范性引用文件​​

• 核心引用标准：
  • GB 4789.2（菌落总数测定）
  • GB 4789.28-2024（培养基和试剂质量要求）
  • GB 4789.35-2023（乳酸菌检验）
  • GB/T 38483（抑菌圈法测定抗细菌活性）
  • GB 7300.502-2023（植物乳杆菌饲料添加剂规范）

​​三、材料与设备​​

1. ​​菌株来源​​

• ​​试验菌株​​：马肠道内容物及黏膜分离的乳酸菌。
• ​​指示菌株​​：
  • 伤寒沙门氏菌（CMCC(B)50071）
  • 大肠埃希氏菌（ATCC 25922）
  • 金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003）

2. ​​仪器设备​​

• 超净工作台、厌氧培养装置、酶标仪、细菌麦氏浊度仪、高速离心机（≥8000 rpm）、PCR仪、电泳系统、超声波细胞破碎仪等（详见附录A）。

3. ​​试剂与耗材​​

• ​​关键试剂​​：
  • DPPH自由基清除试剂盒
  • 30种抗生素纸片（如头孢呋辛、万古霉素等）
  • 乳酸菌生化鉴定管（七叶苷、麦芽糖、甘露醇等11种）
• ​​耗材​​：微孔板（96孔）、0.22 μm滤膜、牛津杯、无菌培养皿等。

4. ​​溶液配制​​

• 培养基按标准配制（如MRS肉汤/琼脂、血琼脂平板、人工胃液/肠液等），pH精确控制（如人工胃液pH=3.0）。

​​四、乳酸菌筛选流程​​

1. ​​分离与纯化​​

• ​​取样部位​​：盲肠、结肠或直肠。
• ​​步骤​​：
  1. 样品稀释（10⁻⁵~10⁻⁷ g/mL）；
  2. 涂布含溴甲酚紫的MRS琼脂培养基；
  3. 37℃厌氧培养24~36小时，挑取产酸变黄单菌落纯化。

2. ​​复筛（性能评价）​​

• ​​石蕊牛奶试验​​：产酸凝乳（粉色）为阳性。
• ​​产酸性能​​：测0~36小时pH值，筛选pH≤4.5的菌株。
• ​​生长曲线​​：酶标仪测OD₆₀₀值。
• ​​耐受性测试​​：
  • 耐酸性（pH 2.0~4.0）
  • 耐胆盐（0.2~0.4 g/L）
• ​​人工消化液模拟​​：
  • 胃液（pH=3.0）和肠液（pH=8.0）处理2小时，平板计数存活率。
• ​​耐热性​​：37~65℃水浴10分钟，检测存活率。

3. ​​安全性评价​​

• ​​溶血性​​：哥伦比亚血平板培养24小时，无溶血为合格。
• ​​抗生素敏感性​​：纸片扩散法测定30种抗生素的抑菌圈直径。

​​五、乳酸菌鉴定方法​​

1. ​​形态学鉴定​​
   • 革兰氏染色镜检：阳性无芽孢菌，球状或杆状。
2. ​​生化鉴定​​
   • 成套生化管测试糖发酵等特性，参照《伯杰细菌鉴定手册》。
3. ​​分子生物学鉴定​​
   • 按GB 7300.502-2023执行（16S rRNA基因测序）。
4. ​​抑菌性能​​
   • 抑菌圈法（GB/T 38483）测试对3种指示菌的抑制效果。
5. ​​抗氧化性​​
   • DPPH自由基清除能力测试：
     • 细胞外发酵上清液（EFS）
     • 完整细胞（IC）
     • 细胞内提取物（ICE）

​​六、保藏方法​​

• 冻干保藏、超低温冷冻（≤-70℃）或其他有效方法。

​​七、附录A（规范性）​​

• ​​仪器清单​​：共15类设备（如厌氧培养装置、PCR仪）。
• ​​试剂规格​​：详列DPPH试剂盒、抗生素纸片种类、生化鉴定管成分。
• ​​培养基配制​​：
  • MRS培养基（含溴甲酚紫显色配方）
  • 人工胃液（0.3%胃蛋白酶+HCl调pH=3.0）
  • 人工肠液（胰蛋白酶+胆盐调pH=8.0）

​​八、其他说明​​

• ​​专利声明​​：文件可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
• ​​归口单位​​：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）。
• ​​起草单位​​：内蒙古农牧业科学院、内蒙古农业大学等10家机构。

​​总结​​：该标准系统规定了马肠道乳酸菌从分离、性能筛选（产酸/耐受性/安全性）到综合鉴定（形态/生化/分子/功能）的全流程技术规范，强调标准化操作及安全性控制，适用于科研与产业应用。