DB1302/T 397-2014 动物产品中动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法

​​唐山市地方标准 DB1302/T 397-2014《动物产品中动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》主要内容总结​​

​​1. 标准概述​​

本标准由唐山市质量技术监督局提出，唐山市农牧局归口，唐山市畜牧水产品质量监测中心起草，规定了通过实时荧光PCR技术检测动物产品中13种动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉貉）源性成分的定性方法，适用于相关动物产品的成分鉴定。

​​2. 核心原理​​

• ​​技术基础​​：基于TaqMan探针实时荧光PCR技术，通过物种特异性基因序列设计引物和探针。
• ​​流程​​：
  1. ​​DNA提取​​：裂解细胞后，利用DNA制备膜技术纯化DNA。
  2. ​​PCR扩增​​：以提取的DNA为模板，通过特异性引物和荧光探针扩增目标片段。
  3. ​​结果判定​​：根据荧光信号强度（Ct值）判断是否含有特定动物源性成分。

​​3. 关键术语与定义​​

• ​​Ct值​​：荧光信号达到阈值时的循环数，用于定量分析。
• ​​TaqMan探针​​：5'端带荧光基团、3'端带淬灭剂的寡核苷酸探针。
• ​​动物源性成分​​：指各物种（如猪、牛等）的特异性DNA片段。
• ​​缩略语​​：包括DNA、PCR等基本分子生物学术语。

​​4. 实验材料与试剂​​

​​4.1 设备与材料​​

• 主要仪器：实时荧光PCR仪、高速离心机（≥12,000 r/min）、紫外灯、水浴锅等。
• 辅助工具：灭菌剪刀/镊子、微量移液器、PCR反应管、离心管等。

​​4.2 试剂​​

• ​​DNA提取试剂盒​​：含蛋白酶K、RNase A、多种缓冲液（GL、GB、WA、WB等）及离心柱。
• ​​检测试剂盒​​：针对13种动物的特异性引物和探针混合液，需-20℃保存。
• 其他：无水乙醇、超纯水（符合GB/T 6682一级标准）。

​​5. 检测步骤​​

​​5.1 DNA提取​​

1. ​​样品处理​​：取2–25 mg样品剪碎，加入裂解液（缓冲液GL+蛋白酶K+RNase A），56℃水浴裂解。
2. ​​纯化​​：通过离心柱结合缓冲液GB、乙醇等步骤纯化DNA，最终用洗脱缓冲液回收DNA。

​​5.2 实时荧光PCR检测​​

1. ​​反应体系​​（20 μL）：
   • 2X预混液（10 μL）、引物混合液（4 μL）、探针混合液（2 μL）、模板DNA（2 μL）、ddH₂O（2 μL）。
   • 设空白对照（水）、阴性对照（非目标DNA）、阳性对照（目标物种DNA）。
2. ​​扩增程序​​：
   • 50℃ 2 min → 95℃ 10 min → 40循环（95℃ 15 s → 60℃ 45 s，60℃收集荧光）。

​​6. 结果判定​​

• ​​有效性标准​​：
  • 空白/阴性对照：无扩增曲线或Ct>40。
  • 阳性对照：典型扩增曲线且Ct≤35。
• ​​样品判定​​：
  • ​​检出​​：Ct≤35且有典型扩增曲线（如“检出猪源性成分”）。
  • ​​未检出​​：Ct>40或无扩增曲线。
  • ​​可疑结果（35<Ct<40）​​：需复测，若复测Ct仍<40则判定为检出。
• ​​方法检出限​​：0.1 g/kg（即样品中目标成分的最低可检测浓度）。

​​7. 其他要点​​

• ​​分区操作​​：DNA提取（样品配置区）、PCR体系配制（扩增区）、结果分析（产物分析区），防止污染。
• ​​试剂保存​​：缓冲液WB需加乙醇后使用，GL沉淀需65℃溶解。
• ​​质量控制​​：实验需同时包含三类对照，确保结果可靠性。

​​总结​​

本标准详细规范了从样品处理、DNA提取到实时荧光PCR检测的全流程，重点强调物种特异性引物设计、实验分区操作和结果判定的科学性，适用于动物产品中多种源性成分的高灵敏度（0.1 g/kg）定性检测，为食品安全和物种鉴定提供技术依据。